Xác định dư lượng nhóm Sulfonamide trong sữa bò tươi nguyên liệu bằng cách nào và phải tuân thủ những nguyên tắc gì?

Nội dung chính

• Xác định dư lượng nhóm Sulfonamide trong sữa bò tươi nguyên liệu theo nguyên tắc nào?
• Việc lấy mẫu thử để xác định dư lượng nhóm Sulfonamide trong sữa bò tươi nguyên liệu như thế nào?
• Xác định dư lượng nhóm Sulfonamide trong sữa bò tươi nguyên liệu bằng cách nào?

Xác định dư lượng nhóm Sulfonamide trong sữa bò tươi nguyên liệu theo nguyên tắc nào?

Nguyên tắc xác định dư lượng nhóm Sulfonamide trong sữa bò tươi nguyên liệu được quy định tại Mục 2 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11219:2015 về Sữa bò tươi nguyên liệu - Xác định dư lượng nhóm sulfonamide - Phương pháp sắc kí lỏng như sau:

Nguyên tắc

Sulfonamide trong các phần mẫu thử được chiết bằng cloroform-axeton. Sau khi làm bay hơi dung môi, phần còn lại được hòa tan trong dung dịch kali phosphat. Phần chất béo còn lại được chiết bằng hexan. Phần nước được lọc và phân tích bằng sắc ký lỏng (LC). Sulfonamide được xác định bằng đo độ hấp thụ UV ở bước sóng 265 nm. Bảy loại sulfonamide có thể được định lượng gồm bốn sulfonamide sử dụng 12% metanol và ba sulfonamide sử dụng 30% metanol trong pha động.

Theo đó, xác định dư lượng nhóm Sulfonamide trong sữa bò tươi nguyên liệu theo nguyên tắc sau đây:

Sulfonamide trong các phần mẫu thử được chiết bằng cloroform-axeton. Sau khi làm bay hơi dung môi, phần còn lại được hòa tan trong dung dịch kali phosphat. Phần chất béo còn lại được chiết bằng hexan.

Phần nước được lọc và phân tích bằng sắc ký lỏng (LC). Sulfonamide được xác định bằng đo độ hấp thụ UV ở bước sóng 265 nm.

Bảy loại sulfonamide có thể được định lượng gồm bốn sulfonamide sử dụng 12% metanol và ba sulfonamide sử dụng 30% metanol trong pha động.

Xác định dư lượng nhóm Sulfonamide trong sữa bò tươi nguyên liệu (Hình từ Internet)

Việc lấy mẫu thử để xác định dư lượng nhóm Sulfonamide trong sữa bò tươi nguyên liệu như thế nào?

Việc lấy mẫu thử để xác định dư lượng nhóm Sulfonamide trong sữa bò tươi nguyên liệu được quy định tại Mục 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11219:2015 về Sữa bò tươi nguyên liệu - Xác định dư lượng nhóm sulfonamide - Phương pháp sắc kí lỏng như sau:

- Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6400:2010 (ISO 707:2008/IDF 50:2008) về Sữa và các sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu.

- Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

- Mẫu thử được bảo quản lạnh ở nhiệt độ dưới 10 °C. Nếu mẫu chưa được phân tích trong vòng 2 ngày đến 3 ngày thì bảo quản đông lạnh ở - 80 °C trong các ống nghiệm polypropylen (4.3) với các lượng nhỏ. Nếu không, bảo quản các phần mẫu thử đông lạnh trong tủ lạnh đông (4.8) ở nhiệt độ càng thấp càng tốt. Rã đông mẫu dưới vòi nước ấm trong ngày phân tích và lắc trộn kỹ mẫu sữa trước khi lấy để phân tích.

- Khi bảo quản ở - 80°C, sữa và các dư lượng sulfonamide có thể bền được khoảng 12 tháng khi được bảo quản ở - 15°C có thể bền được khoảng 3 tháng đến 4 tháng.

Xác định dư lượng nhóm Sulfonamide trong sữa bò tươi nguyên liệu bằng cách nào?

Cách thức tiến hành xác định dư lượng nhóm Sulfonamide trong sữa bò tươi được quy định tại Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11219:2015 về Sữa bò tươi nguyên liệu - Xác định dư lượng nhóm sulfonamide - Phương pháp sắc kí lỏng như sau:

- Chiết

Đặt giấy lọc gấp nếp (tiểu mục 4.5 Mục 5) vào phễu (tiểu mục 4.12 Mục 4 ), dùng 5 ml dung dịch chiết (tiểu mục 3.6 Mục 6) để rửa bộ lọc và loại bỏ nước rửa. Dùng pipet lấy 10 ml (tiểu mục 4.10 Mục 4) mẫu thử cho vào phễu chiết (tiểu mục 4.11 Mục 4).

CHÚ THÍCH: Khi cần thực hiện phép thử độ thu hồi, thêm chuẩn vào các phần thử trắng bằng cách thêm 50 μl, 100 μl, hoặc 200 μl dung dịch thêm chuẩn vào 10 ml sữa đựng trong phễu chiết (tiểu mục 4.11 Mục 4) (thu được các mẫu trắng thêm chuẩn chứa 5 ng/ml, 10 ng/ml hoặc 20 ng/ml).

Bổ sung 50 ml dung dịch chiết vào phần mẫu thử đựng trong phễu chiết (tiểu mục 4.11 Mục 4), đậy nắp, lắc mạnh 1 min, mở hé nắp cẩn thận. Không mở van khóa vì chất khô sữa có thể làm tắc nghẽn khóa dẫn đến việc mất mẫu.

Lắc thêm 1 min, mở hé nắp và để tách pha 1 min. Lặp lại thao tác lắc liên tục và để tách pha trong 5 min. Tháo dung dịch chiết, lọc qua giấy lọc gấp nếp (tiểu mục 4.5 Mục 5) và thu vào bình quả lê (tiểu mục 4.13 Mục 4).

CHÚ Ý: Cẩn thận không để sữa đi vào van khóa.

Cho 25 ml dung dịch chiết vào phễu chiết (tiểu mục 4.11 Mục 4) và lặp lại chính xác như trên. Sau khi lọc dịch chiết lần thứ hai vào cùng một bình quả lê (tiểu mục 4.13 Mục 4), rửa sạch bộ lọc hai lần bằng 5 ml dung dịch chiết, thu lấy nước rửa vào cùng một bình quả lê nêu trên.

- Chuẩn bị phần mẫu thử

Cẩn thận làm bay hơi dung dịch chiết vừa đến khô trên bộ cô quay (tiểu mục 4.2 Mục 4) ở 32 °C ± 2 °C. Trong vài phút đầu tiên, điều tiết chân không để tránh tạo bọt.

Hòa tan phần còn lại trong 1 ml dung dịch kali dihydro phosphat 0,1 M (tiểu mục 3.2 Mục 3), bằng cách lắc trộn mạnh 1 min trên máy trộn Vortex (tiểu mục 4.7 Mục 4).

Thêm ngay 5 ml hexan (tiết 3.3.2 tiểu mục 3.3 Mục 3) và trộn 1 min trên máy Vortex (tiểu mục 4.7 Mục 4). Để tách pha trong 2 min, sau đó trộn ngay thêm 1 min trên máy Vortex (tiểu mục 4.7 Mục 4). Để tách pha ít nhất 15 min trước khi lấy lớp nước (phía dưới) ra.

Sử dụng pipet 1 ml (tiểu mục 4.10 Mục 4), tháo ngay lớp nước và đặt ngay bộ lọc đầu tip pipet nylon lên đầu tip pipet.

CHÚ THÍCH: Lớp nước sẽ đồng nhất, vì vậy không cần thiết loại bỏ 100%, chỉ cần 50% đến 75% lớp nước là đủ cho 2 hai lần bom.

Lọc lớp nước vào ống nghiệm thủy tinh hoặc lọ bơm mẫu tự động (hoặc chia nhỏ thành 2 lọ nếu sử dụng 2 hệ thống sắc ký lỏng).

Các phần mẫu thử đã chuẩn bị có thể được bảo quản trong lọ bơm mẫu tự động ở nhiệt độ phòng qua đêm hoặc đựng trong các lọ bơm kín giữ ở nhiệt độ nhỏ hơn 10 °C đến 24 h trước khi bơm.

- Hệ thống sắc ký

Sử dụng hai hệ thống pha động để phân giải bảy loại sulfonamide:

+ Hệ dung môi pha động 12% (tiết 3.4.1 tiểu mục 3.4 Mục 3) đối với SDZ, STZ, SPD, SMR.

+ Hệ dung môi pha động 30% (tiết 3 4.2 tiểu mục 3.4 Mục 3) đối với SCP, SDM và SQX.

Thiết lập 2 hệ thống LC riêng biệt cho 2 pha động hoặc nếu chỉ có sẵn một hệ thống LC thì phân tích các dịch mẫu dịch chiết sử dụng hệ dung môi pha động 12% đầu tiên, sau đó cân bằng 1 h với hệ dung môi pha động 30% và phân tích các phần mẫu thử chiết còn lại.

Cân bằng lại hệ dung môi pha động 12% trong vài giờ hoặc qua đêm với tốc độ dòng giảm. Để tối ưu hóa độ phân giải cho các cột LC và máy bơm khác nhau, thay đổi nồng độ metanol trong pha động trong khoảng từ 10% đến 30%.

CHÚ THÍCH: Việc sử dụng các hệ dung môi pha động 12% và 30% làm giảm thiểu ảnh hưởng nền và cung cấp độ phân giải đầy đủ cho tất cả bảy sulfonamide, nhưng không nhất thiết phải phản ánh độ phân giải tốt nhất cho từng sulfonamide.

- Đường chuẩn

Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống trước khi xác định bằng cách bơm 100 μl các dung dịch chuẩn sulfonamide nồng độ 5, 10 và 20 ng/ml lặp lại theo cả hai điều kiện LC. Chuẩn bị bảy đường chuẩn sử dụng chiều cao pic.

- Xác định mẫu

Bơm lặp lại hai lần 100 μl dịch chiết phần mẫu thử đã hòa tan lại (5.3) vào hệ thống LC.