Việc định dạng vi khuẩn Aeromonas Hydrophila ở cá bằng kít thương mại trong phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn được thực hiện dựa trên những tiêu chí nào?

Nội dung chính

• Thuốc thử và vật liệu thử dùng trong phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn gồm những loại nào?
• Việc định danh vi khuẩn Aeromonas Hydrophila ở cá bằng kít thương mại trong phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn được thực hiện dựa trên những tiêu chí nào?
• Định danh vi khuẩn Aeromonas Hydrophila bằng bộ kít API 20 E trong phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn thực hiện ra sao?

Thuốc thử và vật liệu thử dùng trong phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn gồm những loại nào?

Theo Mục 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-15:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 15: Bệnh nhiễm trùng do Aeromonas Hydrophila ở cá quy định về thuốc thử và vật liệu thử dùng trong phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn như sau:

"3. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ các trường hợp có quy định khác.

3.1. Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung.

3.1.1. Etanol, từ 70 % (thể tích), 90 % (thể tích) và etanol tuyệt đối.

3.2. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp giám định sinh hóa.

3.2.1. Thạch dinh dưỡng (NA).

3.2.2. Thạch chọn lọc Aeromonas spp. (Rimler-Shotts - R-S).

3.2.3. Thuốc thử cho phương pháp nhuộm Gram (xem A.1).

3.3. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp PCR.

3.3.1. Cặp mồi (primes), gồm mồi xuôi và mồi ngược.

3.3.2. Agarose.

3.3.3. Dung dịch đệm TAE (Tris-brorate - EDTA) hoặc TBE (Tris-acetate - EDTA) (xem A.2).

3.3.4. Chất nhuộm màu, ví dụ: Sybr safe.

3.3.5. Chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X)

3.3.6. Dung dịch đệm TE (Tris-EDTA).

3.3.7. Thang chuẩn ADN (Marker)

3.3.8. Nước tinh khiết, không có nuclease.

3.3.9. Kít nhân gen (PCR Master Mix Kit).

3.3.10. Kít tách chiết ADN (acid deoxyribo nucleic), protein K."

Theo đó thuốc thử và vật liệu thử dùng trong phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn gồm:

- Etanol, từ 70 % (thể tích), 90 % (thể tích) và etanol tuyệt đối.

- Thạch dinh dưỡng (NA).

- Thạch chọn lọc Aeromonas spp. (Rimler-Shotts - R-S).

- Thuốc thử cho phương pháp nhuộm Gram.

Việc định dạng vi khuẩn Aeromonas Hydrophila ở cá bằng kít thương mại trong phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn được thực hiện dựa trên những tiêu chí nào? (Hình từ Internet)

Việc định danh vi khuẩn Aeromonas Hydrophila ở cá bằng kít thương mại trong phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn được thực hiện dựa trên những tiêu chí nào?

Theo tiết 6.1.4.2.2 tiểu mục 6.1 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-15:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 15: Bệnh nhiễm trùng do Aeromonas Hydrophila ở cá quy định về xác định đặc tính sinh hóa như sau:

"6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1. Giám định Aeromonas hydrophila bằng phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn.

...

6.1.4.2.2. Xác định đặc tính sinh hóa.

- Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống: Xác định vi khuẩn dựa vào một số chỉ tiêu cơ bản: Vi khuẩn gram âm, oxidase dương tính, catalase dương tính và một số đặc tính sinh hóa đặc trưng được trình bày trong Bảng 1. Tiến hành các phản ứng sinh hóa (xem Phụ lục B).

- Định danh vi khuẩn bằng kít thương mại (ví dụ bộ kít API 20E): Xác định vi khuẩn dựa vào một số chỉ tiêu cơ bản: Vi khuẩn gram âm, oxidase dương tính, catalase dương tính, O/F dương tính và các chỉ tiêu sinh hóa nêu trong Bảng 2. Tiến hành các phản ứng sinh hóa bằng bộ kít API 20E (tham khảo Phụ lục C).

Như vậy, việc định dạng vi khuẩn Aeromonas Hydrophila trên mẫu bệnh phẩm được thực hiện dựa trên bảng 2 theo Tiêu chuẩn nêu trên.

Định danh vi khuẩn Aeromonas Hydrophila bằng bộ kít API 20 E trong phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn thực hiện ra sao?

Theo Phụ lục C Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-15:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 15: Bệnh nhiễm trùng do Aeromonas Hydrophila ở cá quy định về định dang vi khuẩn bằng bộ kít API 20 E như sau:

C.1. Cách tiến hành

Dùng que tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào 5 ml nước muối sinh lý hoặc nước cất tiệt trùng, lắc trộn đều.

Cho một ít nước vào khay nhựa của bộ kít để giữ ẩm khi ủ trong tủ ấm (4.1.5).

Dùng pipet với đầu týp tiệt trùng hút dung dịch vi khuẩn cho vào mỗi ô của bộ kít. Nhỏ dung dịch vi khuẩn vừa đủ vào tất cả các ô CIT, VP, GEL thì nhỏ đầy, 5 ô ADH, LDC, ODC, H2S và URE cho thêm Parafin tiệt trùng để tạo điều kiện yếm khí.

Đậy nắp khay lại và ủ trong tủ ấm (4.1.5).

C.2. Đọc kết quả

Đọc kết quả sau 18 h đến 24 h

- Kiểm tra và ghi nhận tất cả các chỉ tiêu không cần cho thêm thuốc thử đọc kết quả dựa vào Bảng C.1.

- Các chỉ tiêu cần sử dụng thuốc thử

+ TDA: Nhỏ một giọt thuốc thử TDA. Màu đen xuất hiện thì kết quả là phản ứng dương tính, màu vàng thì kết quả phản ứng âm tính.

+ IND: Nhỏ một giọt thuốc thử JAMES. Đợi 2 min, xuất hiện một vòng màu đỏ là phản ứng dương tính, màu vàng là âm tính

+ VP: Thêm một giọt lần lượt mỗi dung dịch thuốc thử VP1, VP2. Đợi ít nhất 10 min, màu hồng hoặc đỏ xuất hiện là phản ứng dương tính. Nếu màu hồng nhạt xuất hiện trong vòng 10 min đến 12 min là phản ứng âm tính.

Theo tiêu chuẩn trên thì cần dùng que tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào 5 ml nước muối sinh lý hoặc nước cất tiệt trùng, lắc trộn đều.Cho một ít nước vào khay nhựa của bộ kít để giữ ẩm khi ủ trong tủ ấm.

Dùng pipet với đầu týp tiệt trùng hút dung dịch vi khuẩn cho vào mỗi ô của bộ kít. Nhỏ dung dịch vi khuẩn vừa đủ vào tất cả các ô CIT, VP, GEL thì nhỏ đầy, 5 ô ADH, LDC, ODC, H2S và URE cho thêm Parafin tiệt trùng để tạo điều kiện yếm khí. Đậy nắp khay lại và ủ trong tủ ấm

Sau 18 giờ đến 24 giờ thì đọc kết quả quả thu được dựa trên các chỉ tiêu định danh theo bảng C.1 nêu trên.