Thực hiện tách chiết ADN trong phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm như thế nào?

Nội dung chính

• Trong phương pháp pháp PCR việc tăng sinh vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm được thực hiện ra sao?
• Thực hiện tách chiết ADN trong phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm như thế nào?
• Thiết bị dụng cụ dùng trong phương pháp PCR gồm những loại thiết bị dụng cụ nào?

Trong phương pháp pháp PCR việc tăng sinh vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm được thực hiện ra sao?

Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm (Hình từ Internet)

Theo tiết 6.2.2.2 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-19:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm quy định về thực hiện tăng sinh vi khuẩn như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.2.2 Phương pháp PCR

...

6.2.2.2 Tăng sinh vi khuẩn

Mẫu sau khi xử lý (xem 6.1.2) được tăng sinh trong môi trường pepton kiềm (xem 3.3.1) theo tỷ lệ 1:10, ủ ở tủ ấm (xem 4.1.3) từ 28 °C đến 30 °C từ 18 giờ đến 24 giờ.

CHÚ Ý: Khi xét nghiệm mẫu tôm có triệu chứng, bệnh tích điển hình có thể tách chiết ADN trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm mà không cần phải qua bước tăng sinh (Mẫu bệnh phẩm được nghiền thành huyễn dịch 10 % với dung dịch PBS (xem Phụ lục A). Sau đó ly tâm 1500 g trong 10 phút. Thu dịch nổi dùng cho tách chiết ADN vi khuẩn)

...

Mẫu bệnh phẩm sau khi được xử lý thì được tăng sinh trong môi trường pepton kiềm theo tỷ lệ 1:10, ủ ở tủ ấm từ 28 °C đến 30 °C từ 18 giờ đến 24 giờ.

Khi xét nghiệm mẫu tôm có triệu chứng, bệnh tích điển hình có thể tách chiết ADN trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm mà không cần phải qua bước tăng sinh (Mẫu bệnh phẩm được nghiền thành huyễn dịch 10 % với dung dịch PBS. Sau đó ly tâm 1500 g trong 10 phút. Thu dịch nổi dùng cho tách chiết ADN vi khuẩn)

Thực hiện tách chiết ADN trong phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm như thế nào?

Theo Phụ lục C Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-19:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm quy định việc tách chiết ADN bằng phương pháp sốc nhiệt như sau:

Kỹ thuật tách chiết ADN vi khuẩn bằng phương pháp sốc nhiệt

Cụ thể, gồm các bước như sau:

- Chuyển 1 ml dịch tăng sinh vào ống eppendorf. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi, giữ lại phần sinh khối kết tụ ở đáy.

- Huyền phù sinh khối trong 1ml nước muối sinh lý đã được hấp tiệt trùng. Vortex mạnh để sinh khối được trộn đều trong nước. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dịch nổi, giữ lại phần sinh khối kết tụ ở đáy.

- Bổ sung 250 µl nước muối sinh lý đã được hấp tiệt trùng. Vortex mạnh để trộn đều sinh khối.

- Đặt ống eppendorf vào block nhiệt khô 95°C trong 20 phút.

- Đặt ống eppendort vào khay đá để giảm nhanh nhiệt độ từ nóng xuống lạnh trước khi ly tâm.

- Ly tâm ở nhiệt độ từ 20°C đến 25°C tốc độ 10000 vòng/phút trong 3 phút.

- Chuyển 100 µl dịch nổi bên trên chứa ADN sang 1 ống mới.

ADN sau tách chiết bảo quản 4°C đến 8°C trong 24 giờ, hoặc lưu -20°C nếu chưa thực hiện phản ứng ngay.

Theo đó, quy trình tách chiết ADN bằng phương pháp sốc nhiệt khi chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm theo phương pháp PCR được thực hiện theo tiêu chuẩn nêu trên.

Thiết bị dụng cụ dùng trong phương pháp PCR gồm những loại thiết bị dụng cụ nào?

Theo Mục 4 Phụ lục C Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-19:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm quy định về thiết bị, dụng cụ dùng trong phương pháp PCR như sau:

Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm sinh học, bao gồm những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1 Thiết bị, dụng cụ sử dụng chung

4.1.1 Tủ lạnh: tủ lạnh thường (từ 0°C đến 8 °C), tủ lạnh âm sâu (từ âm 20 °C đến âm 80 °C);

4.1.2 Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2;

4.1.3 Tủ ấm, duy trì nhiệt độ ở 28 °C đến 30 °C;

4.1.4 Máy lắc trộn vortex, có thể hoạt động với tốc độ từ 200 g đến 2500 g;

4.1.5 Nồi hấp vô trùng, duy trì nhiệt độ 115 °C và 121 °C;

4.1.6 Cối, chày sứ, kéo, panh kẹp, que cấy vô trùng;

4.1.7 Dụng cụ tiêu hao như: găng tay, khẩu trang, bảo hộ cá nhân.

4.2 Phương pháp nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn

4.2.1 Kính hiển vi quang học, vật kính 10X, 20X, 40X và 100X;

4.2.2 Máy định danh vi khuẩn hoặc thiết bị khác tương đương.

4.3 Phương pháp PCR và Realtime-PCR

4.3.1 Máy nhân gen (PCR, realtime PCR);

4.3.2 Máy ly tâm, có thể thực hiện ở 1500 g đến 2500 g, 10000 g và 12000 g;

4.3.3 Máy lắc ủ nhiệt;

4.3.4 Máy spindown, máy ly tâm lắng;

4.3.5 Máy tách chiết ADN/ARN tự động (nếu có);

4.3.6 Bộ điện di: khay đổ thạch, bể điện di, máy đọc và chụp ảnh gel

Ngoài ra, còn có các loại đầu típ, pipet, ống nghiệm, đĩa petri và các vật tư tiêu hao phù hợp cho quá trình thực hiện các biện pháp kỹ thuật trong tiêu chuẩn này.

Theo đó, thiết bị dụng cụ dùng trong phương pháp PCR gồm:

- Máy nhân gen (PCR, realtime PCR);

- Máy ly tâm, có thể thực hiện ở 1500 g đến 2500 g, 10000 g và 12000 g;

- Máy lắc ủ nhiệt;

- Máy spindown, máy ly tâm lắng;

- Máy tách chiết ADN/ARN tự động (nếu có);

- Bộ điện di: khay đổ thạch, bể điện di, máy đọc và chụp ảnh gel

Ngoài ra, còn có các loại đầu típ, pipet, ống nghiệm, đĩa petri và các vật tư tiêu hao phù hợp cho quá trình thực hiện các biện pháp kỹ thuật để chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy ở tôm.