Thực hiện tách chiết ADN để chuẩn bị cho việc tiến hành phương pháp realtime PCR phát hiện virus gây bệnh Marek ở gà thì cần chuẩn bị những gì?

Nội dung chính

• Bệnh Marek ở gà khác gì so với bệnh Lympho leuko ở gà?
• Thực hiện tách chiết ADN để chuẩn bị cho việc tiến hành phương pháp realtime PCR phát hiện virus gây bệnh Marek ở gà thì cần chuẩn bị những gì?
• Các bước tách chiết ADN được thực hiện theo trình tự như thế nào?

Bệnh Marek ở gà khác gì so với bệnh Lympho leuko ở gà?

Theo tiểu mục 5.4 Mục 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-30:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 30: Bệnh Marek ở gà quy định về việc phân biệt giữa bệnh Marek ở gà và bệnh Lympho leuko ở gà như sau:

Chẩn đoán lâm sàng

...

5.4. Chẩn đoán phân biệt về lâm sàng

Chẩn đoán phân biệt về lâm sàng giữa bệnh Marek và bệnh Lympho leuko theo Bảng 1.

Bảng 1 - So sánh triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể trên gà nhiễm bệnh

Theo tiêu chuẩn nêu trên thì có thể phân biệt bệnh Marek ở gà và bệnh Lympho leuko ở gà dựa theo ngày tuổi của gà, các triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể.

Ví dụ: đối với bệnh Marek thì gà từ vài ngày tuổi sẽ có triệu chứng bệnh như liệt chân, sã cánh. Tuy nhiên đối với bệnh Lympho leuko thì gà phải từ 16 tuần tuổi trở lên mới mắc bệnh và thường không có triệu chứng đặc trưng ở bệnh.

Thực hiện tách chiết ADN để chuẩn bị cho việc tiến hành phương pháp realtime PCR phát hiện virus gây bệnh Marek ở gà thì cần chuẩn bị những gì?

Theo tiết 6.2.3 và tiết 6.2.4 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-30:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 30: Bệnh Marek ở gà quy định về các bước cần chuẩn bị để thực hiện phương pháp realtime PCR như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.2. Phương pháp realtime PCR phát hiện virus gây bệnh Marek

...

6.2.3. Chuẩn bị mẫu

Lấy 1 g mẫu bệnh phẩm (6.2.1) gồm dây thần kinh, gan, lách, nang lông cắt nhỏ, rồi nghiền với dung dịch PBS (3.2.1) theo tỉ lệ 1 : 10 thành huyễn dịch trong cối chày sứ (4.2.6). Ly tâm (4.2.4) huyễn dịch ở gia tốc 3 000 g trong thời gian 5 min rồi hút lấy dịch nổi để tách chiết ADN cho phản ứng realtime PCR.

6.2.4. Cách tiến hành

6.2.4.1. Tách chiết ADN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.4) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: sử dụng kít tách chiết QIAGEN RNeasy Blood tissue (Cat. No. 69506)1) (xem Phụ lục B).

...

Theo đó để tiến hành tách chiết ADN trước tiên cần lấy 1 g mẫu bệnh phẩm gồm dây thần kinh, gan, lách, nang lông cắt nhỏ, rồi nghiền với dung dịch theo tỉ lệ 1 : 10 thành huyễn dịch trong cối chày sứ.

Thực hiện ly tâm huyễn dịch ở gia tốc 3 000 g trong thời gian 5 phút rồi hút lấy dịch nổi để tách chiết ADN cho phản ứng realtime PCR.

Để có thể tách chiết ADN thì cần sử dụng bộ kít tách chiết thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Có thể sử dụng kít tách chiết QIAGEN RNeasy Blood tissue (Cat. No. 69506)1) để tách chiết ADN.

Để thực hiện tách chiết ADN để chuẩn bị cho việc tiến hành phương pháp realtime PCR phát hiện virus gây bệnh Marek ở gà thì cần chuẩn bị những gì? (Hình từ Internet)

Các bước tách chiết ADN được thực hiện theo trình tự như thế nào?

Theo Phụ lục B Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-30:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 30: Bệnh Marek ở gà quy định về việc tách chiết ADN như sau:

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ADN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

Qui trình tách chiết ADN sử dụng kít QIAGEN RNeasy Blood & Tissue kit (Cat. No. 69506) như sau:

B.1. Pha dung dịch

- Dung dịch AW1: thêm 125 ml etanol tuyệt đối (3.2.2) vào 95 ml dung dịch AW1 đậm đặc;

- Dung dịch AW2: thêm 160 ml etanol tuyệt đối (3.2.2) vào 66 ml dung dịch AW2 đậm đặc.

B.2. Cách tiến hành

- Cho 20 ml protease vào ống 1,5 ml;

- Chuyển 200 ml dịch mẫu (dịch nổi xử lý ở 6.2.3) vào ống 1,5 ml;

- Thêm 200 ml dung dịch AL (lysis buffer) vào ống. Lắc bằng máy lắc (4.2.5) trong 15 s, sau đó ly tâm (4.2.4) với gia tốc 3 000 g trong 1 min;

- Ủ ở nhiệt độ 56 °C trong 10 min, sau đó ly tâm (4.2.4) với gia tốc 3 000 g trong 1 min;

- Cho 200 ml etanol tuyệt đối (3.2.2) vào ống. Lắc bằng máy lắc (4.2.5) trong 15 s, sau đó ly tâm với gia tốc 3 000 g trong 1 min;

- Chuyển 620 ml dung dịch mẫu đã tách chiết vào cốc lọc (spin column) với ống thu (collection tube);

- Ly tâm (4.2.4) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Thêm 500 ml dung dịch AW1 vào cột lọc có ống thu ở dưới;

- Ly tâm (4.2.4) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Cho cột lọc vào ống thu mới;

- Thêm 500 ml dung dịch AW2 vào cột lọc có ống thu ở dưới;

- Ly tâm (4.2.4) với gia tốc 20 000 g trong 3 min ở nhiệt độ phòng;

- Chuyển cột lọc sang ống ly tâm 1,5 ml;

- Nhỏ 200 ml dung dịch AE vào cột ly tâm và giữ ở nhiệt độ phòng 1 min;

- Ly tâm (4.2.4) với gia tốc 6 000 g trong 1 min;

- Chuyển ADN đã thu sang ống 1,5 ml mới;

- Bảo quản mẫu ADN ở 4 °C trong ngày nếu chạy phản ứng realtime PCR ngay và giữ ở âm 20 °C để lưu mẫu trong thời gian dài.

Như vậy, việc tách chiết ADN để cho phương pháp realtime PCR được thực hiện theo các bước dựa trên tiêu chuẩn nêu trên.