Thực hiện tách chiết ADN bằng máy TACO để chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm được áp dụng với phương pháp thử nghiệm nào?

Nội dung chính

• Cần phải lấy bao nhiêu cá thể tôm sú giống để chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm
• Thực hiện tách chiết ADN bằng máy TACO để chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm được áp dụng với phương pháp thử nghiệm nào?
• Quy trình tách chiết ADN bằng máy TACO được thực hiện như thế nào?

Cần phải lấy bao nhiêu cá thể tôm sú giống để chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm

Theo tiểu mục 3.3. Mục 3 QCVN 02-34-1:2021/BNNPTNT về Giống tôm nước lợ, tôm biển - Phần 1: Tôm sú, tôm thẻ chân trắng quy định về số lượng mẫu thử phải lấy khi muốn tiến hành thử nghiệm tác nhân gây bệnh ở tôm như sau:

"3. PHƯƠNG PHÁP THỬ

3.1. Thiết bị, dụng cụ

Thiết bị, dụng cụ trong Quy chuẩn này tham khảo tại Phụ lục 2.

3.2. Lấy mẫu kiểm tra chỉ tiêu kỹ thuật

3.2.1. Tôm bố mẹ

Dùng vợt (3.1.2) vớt tôm tại 5 vị trí (4 vị trí xung quanh và giữa) của dụng cụ chứa tôm. Số lượng tôm bố mẹ lấy mẫu để kiểm tra là 20 cá thể với tỷ lệ tôm đực và tôm cái là 1:1. Trường hợp ít hơn 20 cá thể thì lấy toàn bộ số tôm bố mẹ để kiểm tra.

3.2.2. Tôm giống

Dùng vợt (3.1.1) lấy ngẫu nhiên 100 cá thể đến 200 cá thể theo chiều thẳng đứng tại 5 vị trí (4 vị trí xung quanh và giữa) của dụng cụ chứa tôm.

3.3. Lấy mẫu kiểm tra tác nhân gây bệnh

3.3.1. Số lượng mẫu lấy để kiểm tra tác nhân gây bệnh được quy định trong Bảng 4:

3.3.2. Lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu

Theo QCVN 01- 83: 2011/BNNPTTN, Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về bệnh động vật - Yêu cầu chung lấy mẫu bệnh phẩm, bảo quản và vận chuyển, ban hành kèm theo Thông tư số 71/2011/TT-BNNPTNT ngày 25 tháng 10 năm 2011 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn."

Theo đó, số lượng cá thể phải lấy dao động từ 20 đến 30 cá thể trong đàn. Số lượng cá thể được lấy để thử nghiệm tùy thuộc vào tổng số cá thể trong đàn là bao nhiêu theo số lượng được được quy định tại bảng 4 ở Mục 3 QCVN 02-34-1:2021/BNNPTNT nêu trên.

Thực hiện tách chiết ADN bằng máy TACO để chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm được áp dụng với phương pháp thử nghiệm nào? (Hình từ Internet)

Thực hiện tách chiết ADN bằng máy TACO để chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm được áp dụng với phương pháp thử nghiệm nào?

Theo tiểu mục 6.1 Mục 6 TCVN 8710-3:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm quy định về việc chẩn đoán bệnh trong phòng thí nghiệm của tôm như sau:

"6 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1 Phương pháp Nested PCR (Polymerase Chain Reaction)

6.1.4 Cách tiến hành

6.1.4.1 Tách chiết ADN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.3) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kit tách chiết ADN của Qiagen: DNeasy® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506) [1]) (xem phụ lục B1).

Hoặc Sử dụng kit tách chiết TACO RNA/ADN extraction Kít (GeneReach Cat. No. atc-d/rna, 320 tests) [2]) (xem phụ lục B2).

6.1.4.2 Chuẩn bị mồi

Phương pháp Nested PCR sử dụng cặp mồi 146F1/146R1 và 146F2/146R2 (3.2.1) để phát hiện vi rút đốm trắng. Trình tự cặp mồi (xem phụ lục C, Bảng C.1).

Mồi được chuẩn bị như sau:

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy ly tâm nhanh spindown (4.1.5) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Dùng dung dịch đệm TE (3.2.9) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc.

- Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 µM: pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.11) (10 µl mồi gốc và 40 µl nước tinh khiết không có nuclease).

6.1.4.3 Tiến hành phản ứng Nested PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.1.1) theo phương pháp nested PCR bao gồm 2 giai đoạn (hoặc 2 bước): Giai đoạn 1 (bước 1), thực hiện phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 146F1/146R1; Giai đoạn 2 (bước 2), thực hiện phản ứng nested PCR sử dụng cặp mồi 146F2/146R2, sử dụng kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất (xem phụ lục C).

6.1.4.4 Điện di

6.1.4.4.1 Chuẩn bị bản gel

Pha thạch với nồng độ agarose (3.2.12) từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.2.6) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc đều rồi đun sôi;

Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì bổ sung 10 µl chất nhuộm màu (3.2.7) vào mỗi 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều.

Tiến hành đổ thạch vào khay điện di đã được cài lược; không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm.

Khi bản thạch đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản thạch.

Chuyển bản gel vào bể điện di (4.1.6), đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch pha thạch agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.

CHÚ THÍCH: Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm ADN để pha chế thạch agarose (ví dụ: Sybr safe ADN gel stain[3]) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.

6.1.4.4.2 Chạy điện di

Hút 2 µl chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X) (3.2.8) vào 8 µl sản phẩm PCR trộn đều và cho vào các giếng trên bản thạch.

Thực hiện điện di trong bộ điện di (4.1.6), chạy kèm theo thang chuẩn ADN (ladder) (3.2.10) để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang chuẩn ADN (ladder) (3.2.10) vào một giếng trên bản thạch.

Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 25 min.

6.1.4.5 Đọc kết quả

Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc gel (4.1.7).

Điều kiện phản ứng được công nhận khi:

- Mẫu đối chứng âm không có vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại);

- Mẫu đối chứng dương có vạch sáng kích thước 941 bp.

Với điều kiện phản ứng trên:

Kết quả mẫu thử dương tính khi:

- Tại giếng mẫu thử xuất hiện vạch sáng có kích thước 941 bp.

- Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng.

Kết quả mẫu thử âm tính khi:

- Tại giếng mẫu thử không xuất hiện vạch sáng.

- Thang chuẩn ADN phân vạch rõ ràng"

Như vậy, khi thực hiện phương pháp Nested PCR để chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm thì có thể tách chiết ADN bằng máy TACO.

Quy trình tách chiết ADN bằng máy TACO được thực hiện như thế nào?

Theo Mục B.2 Phục lục B TCVN 8710-3:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm quy định về tách chiết ADN bằng TACO RNA/ADN extraction Kít như sau:

"B.2. Tách chiết ADN bằng TACO RNA/ADN extraction Kít

B.2.1 Vật liệu: Bộ kít chiết tách TACO RNA/ADN extraction Kít (GeneReach Cat. No. atc-d/rna, 320 tests)

Etanol 100% (cồn tuyệt đối)

B.2.2 Chuẩn bị:

- Pha dung dịch đệm rửa A(washing buffer A) với 135ml cồn tuyệt đối

- Pha dung dịch đệm rửa B(washing buffer B) với 230ml cồn tuyệt đối

- Tiến hành theo sơ đồ

B.2.3 Chuẩn bị mẫu:

- Cho 250 µL dung dịch đệm vào các ống Eppendort.

- Cho 100 µL/mẫu vào ống eppendort chứa dung đệm.

- Lắc bằng máy votex (4.1.4) trong 15 giây.

- Ly tâm 12000rpm trong 1 phút.

- Cho 350 µL (mẫu và dung dịch đệm) vào các giếng ở cột 1 hoặc 7.

B.2.4 Đưa mẫu vào máy TACO

- Đặt đĩa vào máy TACO

- Đặt lược vào máy TACO.

- Sử dụng máy TACO theo hướng dẫn sử dụng: Máy TACO tự động chiết tách trong khoảng 50 min.

- Thu 100µL ADN/RNA từ các giếng trong cột 6 hoặc 12 sang các ống eppendort mới.

CHÚ Ý: Mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ADN trong cùng thời điểm với mẫu cần phát hiện vi rút đốm trắng."

Theo đó, nếu muốn thực hiện tác chiết ADN bằng máy TACO bạn thực hiện theo quy trình vừa nêu trên.