Quy trình chiết tách ARN để thực hiện chẩn đoán bệnh cúm gia cầm H5N1 được thực hiện ra sao?

Nội dung chính

• Việc chiết tách ARN khi thực hiện phương pháp Realtime RT PCR để chẩn đoán bệnh cúm gia cầm H5N1 ở gà nhằm để làm gì?
• Quy trình chiết tách ARN để thực hiện chẩn đoán bệnh cúm gia cầm H5N1 được thực hiện ra sao?
• Sau khi chiết tách ARN thì tiến hành phương pháp Realtime RT PCR để chẩn đoán bệnh cúm gia cầm H5N1 như thế nào?

Việc chiết tách ARN khi thực hiện phương pháp Realtime RT PCR để chẩn đoán bệnh cúm gia cầm H5N1 ở gà nhằm để làm gì?

Theo tiết điểm a tiết 5.2.2.2 tiểu mục 5.2 Mục 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-26:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1 quy định về việc chiết tách ARN như sau:

Cách tiến hành

...

5.2. Chẩn đoán phòng thí nghiệm

...

5.2.2. Phát hiện kháng nguyên

...

5.2.2.2. Phương pháp Realtime RT-PCR

a) Chiết tách ARN

Sau khi xử lý mẫu, tiến hành chiết tách ARN đối với các dịch bệnh phẩm bằng kit thương mại (xem phụ lục D). ARN thu được sau quá trình chiết tách dùng làm mẫu xét nghiệm.

...

Theo tiểu chuẩn trên thì khi thực hiện phương pháp Realtime RT PCR để chẩn đoán bệnh cúm gia cầm H5N1 thi cần thực hiện bước chiết tách ARN từ các dịch bệnh phẩm bằng kit tách chiết ARN thương mại. ARN thu được sau quá trình chiết tách dùng làm mẫu xét nghiệm.

Quy trình chiết tách ARN để thực hiện chẩn đoán bệnh cúm gia cầm H5N1 được thực hiện ra sao?

Theo Phụ lục D Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-26:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1 thì phương pháp chiết tách ARN được thực hiện như sau:

Dùng huyễn dịch đã xử lý để chiết tách ARN. Có thể sử dụng bộ kít Qiagen® Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc # 74106 250 prep theo quy trình dưới đây:

- Nhỏ 200μl dịch nghiền mô vào ống ly tâm loại 1,5ml cùng với 600μl Qiagen® buffer RLT có 1 % β-ME, lắc đều trên máy Vortex rồi ly tâm nhẹ.

- Thêm 500 μl etanol 70 % vào ống, lắc mạnh bằng máy Vortex rồi ly tâm nhẹ.

- Chuyển tất cả dịch nổi sang cột lọc RNeasy® Qiagen, ly tâm trong 15 s với tốc độ 10.000 r/min ở nhiệt độ phòng.

- Bổ sung 700 μl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột RNeasy® Qiagen, ly tâm trong 15 s ở 10.000 g/min, thay ống thu mới vào cột lọc.

- Nhỏ 500 μl dung dịch rửa RPE buffer vào cột RNeasy® và ly tâm trong 15 s ở 10.000 g/min, thay ống thu mới, lặp lại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer.

- Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu trong 2 min ở tốc độ 12.000 g/min trở lên, bỏ ống thu.

- Đặt cột lọc vào ống thu ARN, nhỏ 50 μl nước sạch nuclease vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 1 min. Tách ARN bằng cách ly tâm trong 1 min ở tốc độ 10.000 g/min, bỏ cột lọc, giữ lại dung dịch trong ống thu ARN.

- Bảo quản mẫu ARN thu được ở 4 °C trong thời gian ngắn trước khi làm RT-PCR, nếu để sau 24 h, nên bảo quản mẫu ở - 20 °C hoặc nhiệt độ thấp hơn.

Quy trình chiết tách ARN để thực hiện chẩn đoán bệnh cúm gia cầm H5N1 được thực hiện ra sao? (Hình từ Internet)

Sau khi chiết tách ARN thì tiến hành phương pháp Realtime RT PCR để chẩn đoán bệnh cúm gia cầm H5N1 như thế nào?

Theo điểm b, điểm c và điểm d tiết 5.2.2.2 tiểu mục 5.2 Mục 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-26:2014 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1 quy định về các bước tiến hành phương pháp Realtime RT PCR như sau:

Cách tiến hành

...

5.2. Chẩn đoán phòng thí nghiệm

...

5.2.2. Phát hiện kháng nguyên

...

5.2.2.2. Phương pháp Realtime RT-PCR

...

b) Tiến hành phản ứng

Tương tự phản ứng Realtime RT-PCR, phản ứng RT-PCR phát hiện vi rút cúm gia cầm trên cơ sở phát hiện các đoạn gen M, H5 và N1 và được thực hiện như sau:

Chuẩn bị mồi ở nồng độ 20 μM với nước sạch Dnase/Rnase (trình tự mồi xem Bảng E1 phụ lục E)

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng RT-PCR để phát hiện mỗi loại gen của vi rút cúm gia cầm theo hướng dẫn của bộ kit được sử dụng (xem Bảng E2 và E3 phụ lục E).

Sản phẩm thu được sau phản ứng RT-PCR đem điện di để đọc kết quả.

c) Điện di sản phẩm RT-PCR:

Pha 1,5 g bột agarose (xem 3.4) với 100 ml dung dịch 1xTAE (xem 3.5), rồi đun nóng trong lò vi sóng cho đến khi tan hoàn toàn. Khi hỗn hợp nguội bớt (khoảng 50 °C đến 60 °C), cho tiếp 2 μl etidi bromua (xem 3.6). Sau đó đổ vào khay và cắm lược. Để gel cứng lại trong khoảng 1 h, rồi rút lược ra.

Đổ đầy dung dịch 1xTAE (xem 3.5) vào bể điện di (đến vạch full level), đặt khay gel vào vị trí trong bể điện di. Pha 2 μl loading dye với 4 μl 100 bp ladder rồi đưa vào giếng đầu tiên của miếng gel. Pha 2 μl loading dye với 8 μl mẫu (đối chứng âm và dương), đưa vào các giếng còn lại của miếng gel.

Điện di gel ở 80 V đến 100 V trong 30 min đến 40 min.

Sau khi điện di xong, đặt gel đã điện di vào máy chiếu UV có bước sóng 590 nm để đọc kết quả.

d) Đọc kết quả:

Kết quả điện di sản phẩm của phản ứng RT-PCR phát hiện các gen M, H5 hoặc N1 được đọc như sau:

Phản ứng RT-PCR phát hiện gen M dương tính hiển thị vạch sản phẩm 201 bp (cặp mồi: M52F và M253R).

Phản ứng RT-PCR phát hiện gen H5 dương tính hiển thị vạch sản phẩm 363bp (cặp mồi: H5F 936 và H5R 1299).

Phản ứng RT-PCR phát hiện gen N1 dương tính hiển thị vạch sản phẩm 150 bp (AI N1-F6 và AI N1-595).

Các phản ứng RT-PCR không hiển thị vạch sản phẩm như xác định ở trên là phản ứng âm tính.

Khi thu được mẫu ARN để thực hiện thí nghiệm thì tiếp theo cần chuẩn bị mồi ở nồng độ 20 μM với nước sạch Dnase/Rnase

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng RT-PCR để phát hiện mỗi loại gen của vi rút cúm gia cầm theo hướng dẫn của bộ kit được sử dụng. Sản phẩm thu được sau phản ứng RT-PCR đem điện di để đọc kết quả.

Kết quả điện di sản phẩm của phản ứng RT-PCR phát hiện các gen M, H5 hoặc N1 được đọc như sau:

- Phản ứng RT-PCR phát hiện gen M dương tính hiển thị vạch sản phẩm 201 bp (cặp mồi: M52F và M253R).

- Phản ứng RT-PCR phát hiện gen H5 dương tính hiển thị vạch sản phẩm 363bp (cặp mồi: H5F 936 và H5R 1299).

- Phản ứng RT-PCR phát hiện gen N1 dương tính hiển thị vạch sản phẩm 150 bp (AI N1-F6 và AI N1-595).

- Các phản ứng RT-PCR không hiển thị vạch sản phẩm như xác định ở trên là phản ứng âm tính.