Phương pháp Realtime PCR cần sử dụng những mẫu bệnh phẩm nào để tiến hành chẩn đoán bệnh roi trùng ở bò?

Nội dung chính

• Để chẩn đoán bệnh roi trùng ở bò bằng phương pháp Realtime PCR thì cần sử dụng một số thiết bị và dụng cụ nào?
• Phương pháp Realtime PCR cần sử dụng những mẫu bệnh phẩm nào để tiến hành chẩn đoán bệnh roi trùng ở bò?
• Cách tiến hành phương pháp Realtime PCR như thế nào để có thể chẩn đoán bệnh roi trùng ở bò?

Để chẩn đoán bệnh roi trùng ở bò bằng phương pháp Realtime PCR thì cần sử dụng một số thiết bị và dụng cụ nào?

Theo Mục 4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-44:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 44: Bệnh roi trùng (Trichomonosis) quy định về thiết bị và dụng cụ dùng trong việc chẩn đoán bệnh roi trùng ở bò như sau:

Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị, dụng cụ sau:

4.1 Thiết bị, dụng cụ dùng chung

4.1.1 Tủ lạnh âm sâu, có thể duy trì nhiệt độ từ âm 20 °C đến âm 80 °C.

4.1.2 Tủ lạnh, có thể duy trì nhiệt độ 2 °C đến 8 °C.

..

4.3 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp PCR, Realtime PCR phát hiện kháng nguyên Tritrichomonas foetus

4.3.1 Máy nhân gen PCR, Realtime PCR.

4.3.2 Máy ly tâm, có thể đạt gia tốc ly tâm 900 g; 6 000 g và 20 000 g.

4.3.3 Máy lắc trộn vortex.

4.3.4 Máy spindown.

4.3.5 Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di.

4.3.6 Máy đọc gel (blue light transilluminator hoặc uv light).

..

Theo đó, để chẩn đoán bệnh roi trùng ở bò bằng phương pháp Realtime PCR thì cần sử dụng một số thiết bị và dụng cụ theo quy định nêu trên.

Phương pháp Realtime PCR cần sử dụng những mẫu bệnh phẩm nào để tiến hành chẩn đoán bệnh roi trùng ở bò? (Hình từ Internet)

Phương pháp Realtime PCR cần sử dụng những mẫu bệnh phẩm nào để tiến hành chẩn đoán bệnh roi trùng ở bò?

Theo tiết 6.5.1, tiết 6.5.2 và tiết 6.5.3 tiểu mục 6.4 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-44:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 44: Bệnh roi trùng (Trichomonosis) quy định về việc chuẩn bị mẫu bệnh phẩm cho phương pháp Realtime PCR như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.5 Phương pháp Realtime PCR phát hiện kháng nguyên Tritrichomonas foetus

6.5.1 Lấy mẫu

Xem 6.1.1

6.5.2 Bảo quản mẫu

Xem 6.1.2

6.5.3 Chuẩn bị mẫu

Mẫu kiểm tra là mẫu dịch âm đạo, tử cung bò cái, hoặc niêm mạc dương vật bò đực, nhau thai.

...

Theo mục 6.1 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-44:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 44: Bệnh roi trùng (Trichomonosis) thì việc lấu mẫu bệnh phẩm được thực hiện như sau:

Lấy mẫu bằng bàn chải chuyên dụng. Trước khi lấy mẫu cần vệ sinh sạch sẽ cơ quan lấy mẫu và vùng xung quanh, không dùng chất sát trùng để tránh làm giảm độ nhạy khi chẩn đoán.

Mẫu bệnh phẩm từ bò cái: Thụt rửa âm đạo bằng dung dịch PBS (xem phụ lục B) hoặc nước muối sinh lý 0.9 % (vô trùng), dịch âm đạo hoặc cạo cổ tử cung bằng pipet thụ tinh nhân tạo hoặc bàn chải chuyên dụng.

Mẫu bệnh phẩm từ bò đực: Dịch dương vật, cạo niêm mạc dương vật hoặc bao quy đầu bằng cách dùng pipet thụ tinh nhân tạo, bàn chải chuyên dụng. Mẫu bệnh phẩm từ bào thai bò: Nhau thai, dịch thai.

Trường hợp phải gửi mẫu tới phòng thí nghiệm và không thể vận chuyển trong vòng 24 giờ, nên sử dụng môi trường vận chuyển chứa kháng sinh (Ví dụ: thioglycollate broth media với kháng sinh, hoặc túi nhựa thực địa. Trong quá trình vận chuyển, nên tránh tiếp xúc với ánh sáng và bảo quản ở 5 °C - 37 °C.

Khi áp dụng phương pháp Realtime PCR để chẩn đoán bệnh roi trùng ở bò thì mẫu kiểm tra phải là mẫu dịch âm đạo, tử cung bò cái, hoặc niêm mạc dương vật bò đực, nhau thai.

Cách tiến hành phương pháp Realtime PCR như thế nào để có thể chẩn đoán bệnh roi trùng ở bò?

Theo tiết 6.5.4 tiểu mục 6.5 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-44:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 44: Bệnh roi trùng (Trichomonosis) thì cách tiến hành phương pháp Realtime PCR như sau:

Bước 1: Tách chiết DNA

Sử dụng bộ kít tách chiết thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: dùng kít tách chiết DNAeasy® Blood & Tissue Kit, Qiagen (Cat. No.69504)5).

Bước 2: Chuẩn bị cặp mồi và mẫu dò

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen theo phương pháp Realtime PCR và sử dụng cặp mồi và mẫu dò nêu trong Phần F1-Phụ lục F Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-44:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 44: Bệnh roi trùng (Trichomonosis).

Mồi và mẫu dò được chuẩn bị như sau:

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindovvn (4.3.4) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.8) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc.

- Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 µM, pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease.

- Mẫu dò được sử dụng ở nồng độ 5 µM: pha loãng mẫu dò gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease.

Bước 3: Tiến hành phản ứng

Sử dụng cặp mồi và mẫu dò đã được chuẩn bị. Thành phần cho một phản ứng và chu trình nhiệt được nêu trong phần F2 phụ lục F Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-44:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 44: Bệnh roi trùng (Trichomonosis).

Bước 4: Đọc kết quả

Đọc kết quả bằng máy nhân gen realtime PCR dựa trên giá trị Ct (Ct là thời điểm máy đọc realtime PCR ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền);

- Phản ứng được công nhận khi: mẫu đối chứng dương tính có giá trị Ct biết trước và mẫu đối chứng âm tính không có giá trị Ct;

Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị Ct ≤ 35 được coi là dương tính; mẫu không có Ct được coi là âm tính; mẫu có giá trị 35 < Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ;

Những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại quy trình xét nghiệm hoặc xét nghiệm bằng phương pháp khác để khẳng định.