Khi áp dụng phương pháp Realtime PCR thì quá trình tách chiết ADN nhằm chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae ở cá được thực hiện theo trình tự ra sao?

Nội dung chính

• Phương pháp Realtime PCR dùng cho việc chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae ở cá hoạt động dựa trên nguyên tắc nào?
• Khi áp dụng phương pháp Realtime PCR thì quá trình tách chiết ADN nhằm chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae ở cá được thực hiện theo trình tự ra sao?
• Thiết bị dụng cụ dùng trong phương pháp Realtime PCR bao gồm những thiết bị dụng cụ nào?

Phương pháp Realtime PCR dùng cho việc chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae ở cá hoạt động dựa trên nguyên tắc nào?

Theo tiết 6.2.2.1 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-21:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 21: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae ở cá quy định về nguyên tắc hoạt động của phương pháp Realtime PCR như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.2 Phát hiện vi khuẩn Streptococcus agalactiae

...

6.2.2 Phương pháp realtime PCR

6.2.2.1 Nguyên tắc

Phương pháp phân tích này dựa vào sự khuếch đại đoạn ADN đích của vi khuẩn Streptococcus agalactiae gây bệnh ở cá được phát hiện thông qua kỹ thuật Realtime PCR, với ADN được tách chiết từ canh thang hoặc từ mẫu bệnh phẩm nhằm rút ngắn tối đa thời gian xét nghiệm.

Nguyên lý của phản ứng SYBR Green realtime PCR là SYBR Green gắn không đặc hiệu với sản phẩm ADN và tín hiệu huỳnh quang tăng tỉ lệ thuận với sản phẩm ADN khi được nhân lên. Chính vì không đặc hiệu nên phương pháp này phải làm thêm bước điện di xác định kích thước vạch sáng của gen đích.

...

Theo đó, phương pháp Realtime PCR là phương pháp phân tích này dựa vào sự khuếch đại đoạn ADN đích của vi khuẩn Streptococcus Agalactiae gây bệnh ở cá được phát hiện thông qua kỹ thuật Realtime PCR, với ADN được tách chiết từ canh thang hoặc từ mẫu bệnh phẩm nhằm rút ngắn tối đa thời gian xét nghiệm.

Nguyên lý của phản ứng SYBR Green realtime PCR là SYBR Green gắn không đặc hiệu với sản phẩm ADN và tín hiệu huỳnh quang tăng tỉ lệ thuận với sản phẩm ADN khi được nhân lên. Chính vì không đặc hiệu nên phương pháp này phải làm thêm bước điện di xác định kích thước vạch sáng của gen đích.

Chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae ở cá (Hình từ Internet)

Khi áp dụng phương pháp Realtime PCR thì quá trình tách chiết ADN nhằm chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae ở cá được thực hiện theo trình tự ra sao?

Theo Phụ lục C Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-21:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 21: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae ở cá quy định về quy trình tách chiết ADN như sau:

Phụ lục C

(Tham khảo)

Kỹ thuật tách chiết ADN vi khuẩn bằng phương pháp sốc nhiệt

Cụ thể, gồm các bước như sau:

- Chuyển 1 ml dịch tăng sinh vào ống eppendorf. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi, giữ lại phần sinh khối kết tụ ở đáy.

- Huyền phù sinh khối trong 1ml nước muối sinh lý đã được hấp tiệt trùng. Vortex mạnh để sinh khối được trộn đều trong nước. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dịch nổi, giữ lại phần sinh khối kết tụ ở đáy.

- Bổ sung 250 μl nước muối sinh lý đã được hấp tiệt trùng. Vortex mạnh để trộn đều sinh khối.

- Đặt ống eppendort vào block nhiệt khô 95°C trong 20 phút.

- Đặt ống eppendort vào khay đá để giảm nhanh nhiệt độ từ nóng xuống lạnh trước khi ly tâm.

- Ly tâm ở nhiệt độ từ 20°C đến 25°C tốc độ 10000 vòng/phút trong 3 phút.

- Chuyển 100 μl dịch nổi bên trên chứa ADN sang 1 ống mới.

ADN sau tách chiết bảo quản 4°C đến 8°C trong 24 giờ, hoặc lưu -20°C nếu chưa thực hiện phản ứng ngay.

CHÚ THÍCH: Kỹ thuật tách chiết ADN vi khuẩn có thể sử dụng bộ kit tách chiết ADN cho kết quả tương đương, ví dụ kit InViMag Bacteria DNA kit/KFml, Catalogue Number: 24331504502)

Theo đó, quy trình tách chiết ADN nhằm chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae ở cá bằng phương pháp Realtime PCR được thực hiện theo quy trình nêu trên.

Thiết bị dụng cụ dùng trong phương pháp Realtime PCR bao gồm những thiết bị dụng cụ nào?

Theo Mục 4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-21:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 21: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus Agalactiae ở cá quy định về thiết bị dụng cụ dùng cho phương pháp Realtime PCR như sau:

Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1 Thiết bị, dụng cụ sử dụng chung

4.1.1 Tủ lạnh: tủ lạnh thường (từ 0°C đến 8 °C), tủ lạnh âm sâu (từ âm 20 °C đến âm 80 °C);

4.1.2 Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2;

4.1.3 Tủ ấm duy trì nhiệt độ ở 28 °C đến 30 °C;

4.1.4 Máy lắc trộn vortex, có thể hoạt động với tốc độ từ 200 g đến 2500 g:

4.1.5 Nồi hấp vô trùng duy trì nhiệt độ 115 °C và 121 °C;

4.1.6 Cối, chày sứ, kéo, panh kẹp, que cấy vô trùng;

4.2 Thiết bị, dụng cụ của phương pháp nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn

4.2.1 Kính hiển vi quang học, vật kính 10X, 20X, 40X và 100X;

4.2.2 Máy định danh vi khuẩn hoặc thiết bị khác tương đương;

4.3 Thiết bị, dụng cụ của phương pháp PCR và Realtime-PCR

4.3.1 Máy tách chiết ADN/ARN tự động (nếu có);

4.3.2 Máy ly tâm;

4.3.3 Máy spindown;

4.3.4 Máy lắc ủ nhiệt;

4.3.5 Máy nhân gen (Realtime - PCR);

4.2.7 Thiết bị điện di: khay đổ thạch, bể điện di, máy đọc và chụp ảnh gel.

Như vậy, thiết bị dụng cụ dùng cho phương pháp Realtime PCR gồm:

- Máy tách chiết ADN/ARN tự động (nếu có);

- Máy ly tâm;

- Máy spindown;

- Máy lắc ủ nhiệt;

- Máy nhân gen (Realtime - PCR);

- Thiết bị điện di: khay đổ thạch, bể điện di, máy đọc và chụp ảnh gel.

- Tủ lạnh: tủ lạnh thường (từ 0°C đến 8 °C), tủ lạnh âm sâu (từ âm 20 °C đến âm 80 °C);

- Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2;

- Tủ ấm duy trì nhiệt độ ở 28 °C đến 30 °C;

- Máy lắc trộn vortex, có thể hoạt động với tốc độ từ 200 g đến 2500 g:

- Nồi hấp vô trùng duy trì nhiệt độ 115 °C và 121 °C;

- Cối, chày sứ, kéo, panh kẹp, que cấy vô trùng.