Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8400-55:2022 hướng dẫn phát hiện virus Myxoma của bệnh u nhày ở thỏ như thế nào?

Nội dung chính

• TCVN 8400-55:2022 hướng dẫn phát hiện virus Myxoma bằng phương pháp phân lập virus trên môi trường tế bào của bệnh u nhày ở thỏ thế nào?
• TCVN 8400-55:2022 hướng dẫn phát hiện virus Myxoma bằng phương pháp realtime PCR của bệnh u nhày ở thỏ thế nào?
• TCVN 8400-55:2022 hướng dẫn phát hiện virus Myxoma bằng phương pháp PCR của bệnh u nhày ở thỏ thế nào?

TCVN 8400-55:2022 hướng dẫn phát hiện virus Myxoma bằng phương pháp phân lập virus trên môi trường tế bào của bệnh u nhày ở thỏ thế nào?

Căn cứ theo tiểu mục 7.3 Mục 7 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-55:2022 hướng dẫn phát hiện virus Myxoma bằng phương pháp phân lập virus trên môi trường tế bào của bệnh u nhày ở thỏ như sau:

(1) Xử lý mẫu

- Mẫu dịch tiết (7.1.1) được trộn đều bằng máy lắc (5.1.4), để ở nhiệt độ phòng trong 30 min. Ly tâm với tốc độ 2 500 rpm trong 5 min đến 10 min. Dùng bơm tiêm (5.1.10) hút 1 ml dịch nổi phía trên, lọc qua mảng lọc (5.3.4). Lưu mẫu trong ống nghiệm 2 ml vô trùng (5.1.8).

- Mẫu mô (7.1.3) được đồng nhất trong cối chày sứ hoặc máy đồng nhất mẫu (5.1.5) với dung dịch MEM (4.3.3) có bổ sung kháng sinh tạo thành hỗn dịch 10 %, ly tâm với tốc độ 2 500 rpm trong 5 min đến 10 min. Lấy 1 ml dịch nổi và lọc qua màng lọc (5.3.4). Lưu mẫu trong ống nghiệm 2 ml (5.1.8).

(2) Cách tiến hành

Bước 1: Chuẩn bị tế bào RK-13

- Rã đông nhanh tế bào RK-13 trong bể điều nhiệt ở 37 °C (5.1.7).

- Chuyển hỗn hợp tế bào vào ống ly tâm 50 ml vô trùng (5.1.8) chứa sẵn 10 ml môi trường phát triển tế bào MEM.

- Trộn đều bằng pipet, ly tâm với tốc độ 200 g trong 5 min ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ phần dịch nổi phía trên.

- Bổ sung 5 ml dung dịch MEM có 10 % FCS (A.2.1, Phụ lục A TCVN 8400-55:2022) vào ống, trộn đều bằng pipet.

- Hút chuyển dung dịch này vào chai nuôi tế bào 25 cm2. Ủ trong tủ ấm có 5 % CO2 (5.3.2).

Quan sát sự phát triển của tế bào hàng ngày dưới kính hiển vi đảo ngược (5.3.1). Sau từ 2 ngày đến 4 ngày sẽ thu được một thảm tế bào. Khi tế bào bao phủ khoảng 80 % chai nuôi cấy thì dùng cho phân lập virus.

Bước 2: Gây nhiễm

- Hút 0,2 ml dung dịch mẫu đã được xử lý (xem 7.3.1.1) vào chai tế bào 1 lớp 25 cm2 đã được chuẩn bị tại bước 1.

- Ủ trong tủ ấm (5.3.2) ở 37 °C trong 1 h. Rửa thảm tế bào bằng 5 ml dung dịch MEM (4.3.3), lặp lại 2 lần

- Bổ sung 5 ml môi trường nuôi tế bào MEM chứa kháng sinh (xem A.2.1, Phụ lục A TCVN 8400-55:2022). Ủ ở 37 °C trong tủ ấm có 5 % CO2 (5.3.2 ) trong 7 ngày.

- Kiểm tra bệnh tích tế bào (CPE) hàng ngày bằng kính hiển vi đảo ngược (5.3.1).

(3) Đánh giá kết quả

- Bệnh tích tế bào thường xuất hiện trong khoảng 24 h đến 48 h sau khi nuôi cấy, có khi lên tới 7 ngày tùy thuộc vào độc lực và chủng virus gây bệnh. CPE có đặc điểm là các tế bào RK-13 tròn to lên, bị dung giải và tách khỏi lớp thảm tế bào, sau đó tất cả tế bào đều bị ảnh hưởng và tách khỏi chai.

- Trong trường hợp quan sát thấy CPE, tiến hành thu hoạch hết hỗn dịch trong chai nuôi tế bào vào ống ly tâm 50 ml (5.1.8), thu dịch nuôi cấy vào ống nghiệm, để đông lạnh rồi rã đông lặp lại 3 lần (đông lạnh dịch nuôi cấy 30 min ở nhiệt độ - 80 °C, rã đông 20 min ở nhiệt độ phòng), đem ly tâm thu dịch nổi để xác định virus bằng phương pháp realtime PCR hoặc PCR.

- Khẳng định virus bằng phương pháp realtime PCR (xem 7.3.2) hoặc PCR (xem 7.3.3)

+ Nếu kết quả realtime PCR/PCR dương tính thì kết luận có virus Myxoma trong mẫu,

+ Nếu kết quả realtime PCR/PCR âm tính, tiến hành phân lập lần 2.

- Trong trường hợp không quan sát thấy bệnh tích tế bào trong 7 ngày nuôi cấy, thu hoạch hỗn dịch tế bào nuôi cấy lần 1 vào ống ly tâm 50 ml (5.1.8), thực hiện đông lạnh và rã đông lặp lại 3 lần, ly tâm với tốc độ 1 500 rpm trong 1 min, thu lấy dịch nổi để nuôi cấy lại lần 2 trên chai tế bào mới. Theo dõi bệnh tích tế bào hàng ngày, nếu trong 7 ngày không xuất hiện bệnh tích tế bào thì kết luận mẫu âm tính với virus Myxoma.

Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8400-55:2022 hướng dẫn phát hiện virus Myxoma của bệnh u nhày ở thỏ như thế nào? (Hình từ Internet)

TCVN 8400-55:2022 hướng dẫn phát hiện virus Myxoma bằng phương pháp realtime PCR của bệnh u nhày ở thỏ thế nào?

Căn cứ theo tiểu mục 7.3 Mục 7 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-55:2022 hướng dẫn phát hiện virus Myxoma bằng phương pháp realtime PCR của bệnh u nhày ở thỏ như sau:

(1) Xử lý mẫu

- Mẫu dịch tiết: Đồng nhất mẫu dịch tiết (xem 7.1.1) bằng máy lắc trộn (5.1.4). Loại bỏ tăm bông, ly tâm ống mẫu với tốc độ 2 500 rpm trong 10 min, loại bỏ cặn thu lấy dịch nổi phía trên vào ống 2 ml (5.1.8) để làm xét nghiệm.

- Mẫu mô (xem 6.1.3) được cắt nhỏ rồi đồng nhất bằng máy đồng nhất hoặc cối chày sứ vô trùng (5.1.5) với dung dịch PBS (xem A.1, Phụ lục A TCVN 8400-55:2022) để thu được huyễn dịch 10 %. Cho huyễn dịch vào ống ly tâm 15 ml, đặt vào máy ly tâm (5.2.3), ly tâm với tốc độ 2 500 rpm trong 10 min. Thu lấy dịch nổi phía trên cho vào ống 2 ml (5.1.8).

(2) Tách chiết ADN

- Chiết tách ADN từ huyễn dịch (xem 7.3.2.1) được bằng các kít thương mại theo chỉ dẫn của nhà sản xuất (tham khảo Phụ lục C TCVN 8400-55:2022) và bảo quản mẫu ADN ở 4 °C nếu xét nghiệm ngay, hoặc bảo quản - 20 °C trong thời gian dài.

(3) Chuẩn bị mồi, mẫu dò

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen theo phương pháp realtime PCR phát hiện đoạn gen M0005L của tất cả các chủng virus Myxoma. Trình tự cặp mồi xuôi, mồi ngược và mẫu dò (xem Bảng D.1, Phụ lục D TCVN 8400-55:2022).

Chuẩn bị mồi như sau:

- Chuẩn bị mồi gốc: Mồi gốc và mẫu dò gốc ở trạng thái đông khô phải được ly tâm với tốc độ 8 000 rpm trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên dùng dung dịch đệm TE để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 pM làm mồi gốc và mẫu dò gốc.

- Chuẩn bị mồi, mẫu dò làm việc:

+ Mồi sử dụng được dùng ở nồng độ 20 μM: Lấy 20 μl mồi gốc pha với 80 μI nước (4.2.10).

+ Mẫu dò được sử dụng ở nồng độ 6 μM: Lấy 6 μl mẫu dò gốc pha với 94 μl nước (4.2.10).

(4) Tiến hành phản ứng realtime PCR

Sử dụng cặp mồi, mẫu dò đã chuẩn bị (xem 7.3.2.3) và bộ kít thương mại, pha hỗn hợp nhân gen (Master mix) và cài đặt chu trình nhiệt theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Lượng hỗn hợp nhân gen dùng cho một phản ứng (xem Bảng D.2, Phụ lục D TCVN 8400-55:2022).

Sau khi chuẩn bị xong hỗn hợp nguyên liệu:

- Hỗn hợp nhân gen: Cho 20 μl hỗn hợp nguyên liệu vào mỗi ống PCR 0,2 ml (5.2.9).

- Đối chứng dương: Cho 5 μl ADN chuẩn dương (4.2.5) vào ống PCR đã có sẵn hỗn hợp nhân gen

- Đối chứng âm: Cho 5 μI nước (4.2.10) vào ống PCR đã có sẵn hỗn hợp nhân gen

- Mẫu xét nghiệm: Cho 5 μl ADN vừa tách chiết (7.3.2.2) vào ống PCR đã có sẵn hỗn hợp nhân gen

- Ly tâm nhẹ cho hỗn hợp không bám trên thành ống

- Đặt ống PCR vào máy realtime PCR (5.2.2)

- Chạy chu trình nhiệt phản ứng (xem Bảng D.3, Phụ lục D TCVN 8400-55:2022).

LƯU Ý: Phản ứng Realtime PCR phải bao gồm: mẫu thử, mẫu đối chứng dương, mẫu đối chứng âm. Mẫu và nguyên vật liệu cho phản ứng Realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

(5) Đọc kết quả

Phản ứng được công nhận: Mẫu đối chứng dương tính (được chuẩn độ trước) phải có giá trị Ct tương đương giá trị Ct đã biết (± 2 Ct), mẫu đối chứng âm không có Ct.

Với điều kiện phản ứng trên:

1) Mẫu có giá trị Ct ≤ 40 được coi là dương tính.

2) Mẫu không có giá trị Ct là âm tính.

3) Mẫu có giá trị 40 < Ct ≤ 45 được coi là nghi ngờ.

Những mẫu nghi ngờ này cần được xét nghiệm lại lần 2 hoặc xét nghiệm bằng phương pháp khác có độ nhạy và độ chính xác cao hơn để khẳng định và đưa ra kết luận cuối cùng.

TCVN 8400-55:2022 hướng dẫn phát hiện virus Myxoma bằng phương pháp PCR của bệnh u nhày ở thỏ thế nào?

Căn cứ theo tiểu mục 7.3 Mục 7 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-55:2022 hướng dẫn phát hiện virus Myxoma bằng phương pháp PCR của bệnh u nhày ở thỏ như sau:

(1) Xử lý mẫu

Thực hiện theo 7.3.2.1 tiểu mục 7.3 Mục 7 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-55:2022.

(2) Tách chiết ADN

Thực hiện theo 7.3.2.2 tiểu mục 7.3 Mục 7 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-55:2022.

(3) Chuẩn bị mồi

Phương pháp PCR sử dụng 03 cặp mồi để phát hiện và phân biệt các chủng virus gây bệnh và chủng virus vắc xin. Tùy thuộc vào đặc điểm dịch tễ cụ thể của từng ca bệnh và mục đích xét nghiệm mà lựa chọn cặp mồi cho phù hợp.

+ Cặp mồi M071F/R: Phát hiện tất cả các chủng virus Myxoma.

+ Cặp mồi VAX-F/M144R: Phát hiện các chủng virus vắc xin.

+ Cặp mồi M140F/R: Phát hiện chủng virus gây bệnh thực địa

Chuẩn bị mồi: xem 7.3.2.3 tiểu mục 7.3 Mục 7 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-55:2022.

(4) Tiến hành phản ứng PCR

Sử dụng cặp mồi đã chuẩn bị (xem 7.3.3.3) và bộ kít thương mại, pha hỗn hợp nhân gen (Master mix) và cài đặt chu trình nhiệt theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Lượng hỗn hợp nhân gen dùng cho một phản ứng (xem Bảng E.2, Phụ lục E TCVN 8400-55:2022).

Sau khi chuẩn bị xong hỗn hợp nguyên liệu:

- Hỗn hợp nhân gen: Cho 18 μl hỗn hợp nhân gen vào ống PCR 0,2 ml (5.2.9).

- Đối chứng dương: Cho 2 μl ADN chuẩn dương (4.2.5) vào ống PCR đã có sẵn hỗn hợp nhân gen

- Đối chứng âm: Cho 2 μl nước (4.2.10) vào ống PCR đã có sẵn hỗn hợp nhân gen

- Mẫu xét nghiệm: Cho 2 μl ADN vừa tách chiết (7.3.2.2) vào ống PCR đã có sẵn hỗn hợp nhân gen

- Ly tâm (5.2.4) cho hỗn hợp không bám trên thành ống

- Đặt ống PCR vào máy nhân gen (5.2.1)

- Chạy chu trình nhiệt phản ứng (xem Bảng E.3, Phụ lục E TCVN 8400-55:2022).

LƯU Ý: Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu thử, mẫu đối chứng dương, mẫu đối chứng âm. Mẫu và nguyên vật liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

(5) Điện di sản phẩm

Chuẩn bị thạch điện di (bản gel)

- Pha thạch agarose 1,5 %: Lấy 1,5 g agarose (4.2.6) hòa trong 100 ml dung dịch đệm TAE 1 X hoặc TBE 1 X (4.2.7) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc đều rồi đun nóng trong lò vi sóng cho đến khi tan hoàn toàn.

- Để nguội đến khoảng 50 °C đến 60 °C, bổ sung chất nhuộm màu (4.2.11) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Lắc nhẹ đề chất nhuộm màu tan đều, tránh tạo bọt. Tiến hành đổ thạch agarose 1,5 % vào khay điện di đã được cài lược (5.2.6), độ dày của bản gel không lớn hơn 8 mm. Khi bản gel đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản gel.

- Chuyển bản gel vào bể điện di (5.2.6), đổ dung dịch đệm TBE 1 X hoặc TAE 1 X (4.2.7) (cùng loại với dung dịch pha agarose) vào bể điện di cho tới khi ngập bản gel.

Chạy điện di

- Cho 2 μl đệm tài mẫu (4.2.8) vào 8 μl sản phẩm PCR mỗi loại mẫu: mẫu kiểm tra, mẫu đối chứng dương, đối chứng âm (7.3.3.4), trộn đều và cho vào các giếng trên bản gel (xem 7.3.3.5.1).

- Cho 2 μl thang chuẩn ADN (4.2.9) vào một giếng trên bản gel.

- Đặt gel trong bể điện di (5.2.6) và điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 30 min đến 40 min. Sau khi điện di xong, phân tích kết quả trên máy đọc gel (5.2.5).

(6) Đọc kết quả

Đọc bản gel vừa điện di (7.3.3.5.2) bằng máy đọc gel (5.2.5):

- Mẫu dương tính: Có hiển thị vạch sản phẩm giống như mẫu đối chứng dương; kích thước sản phẩm tùy thuộc vào cặp mồi sử dụng (xem Bảng E.1, Phụ lục E TCVN 8400-55:2022)

- Mẫu âm tính: Không có vạch sản phẩm xuất hiện giống mẫu đối chứng âm hoặc có hiển thị vạch sản phẩm nhưng không giống kích thước như đối chứng dương.

- Mẫu nghi ngờ: hiển thị vạch sản phẩm không rõ nét hoặc hiển thị nhiều hơn 1 vạch sản phẩm. Trường hợp này cần xét nghiệm lại hoặc sử dụng các phương pháp khác để khẳng định.