Để tách chiết ARN nhằm thực hiện phương pháp realtime RT PCR phát hiện virus gây bệnh Gumboro ở gà thì phải dùng kít tách chiết ARN nào?

Nội dung chính

• Làm thế nào để phân biệt được gà đang mắc bệnh Gumboro hay bệnh cúm gia cầm?
• Để tách chiết ARN nhằm thực hiện phương pháp realtime RT PCR phát hiện virus gây bệnh Gumboro ở gà thì phải dùng kít tách chiết ARN nào?
• Quy trình tách chiết ARN trong phương pháp realtime RT PCR được thực hiện như thế nào?

Làm thế nào để phân biệt được gà đang mắc bệnh Gumboro hay bệnh cúm gia cầm?

Theo tiểu mục 5.4 Mục 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-32:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 32: Bệnh Gumboro ở gia cầm quy định về chẩn đoán phân biệt về lâm sàng như sau:

Chẩn đoán lâm sàng

...

5.4. Chẩn đoán phân biệt về lâm sàng

Chẩn đoán phân biệt về lâm sàng giữa bệnh Gumboro và một số bệnh khác trên gia cầm theo Bảng 1.

Như vậy, có thể dựa theo bảng biểu hiện lâm sàng trên để thực hiện phân biệt giữa bệnh Gumboro và bệnh cúm gia cầm ở gà.

Để tách chiết ARN nhằm thực hiện phương pháp realtime RT PCR phát hiện virus gây bệnh Gumboro ở gà thì phải dùng kít tách chiết ARN nào?

Theo Mục 3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-32:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 32: Bệnh Gumboro ở gia cầm quy định về thuốc thử và vật liệu thử như sau:

Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

3.1. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp parafin

3.1.1. Formalin, dung dịch 10 % (thể tích)

Chuẩn bị từ dung dịch formaldehyde 38 % (thể tích) và dung dịch muối đệm phosphat (PBS) (xem Phụ lục A) với tỷ lệ 1 : 9 (thể tích).

3.1.2. Etanol 70 % (thể tích), 90 % (thể tích) và etanol tuyệt đối.

3.1.3. Xylen.

3.1.4. Haematoxylin.

3.1.5. Eosin.

3.1.6. Parafin, có độ nóng chảy từ 56 °C đến 60 °C.

3.1.7. Keo dán lamen.

3.2. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp realtime RT-PCR (phản ứng phiên mã ngược chuỗi polymerase theo thời gian thực)

3.2.1. Kít tách chiết ARN (axit ribonucleic)

3.2.2. Kít nhân gen, dùng cho phản ứng realtime RT-PCR.

3.2.3. Cặp mồi và mẫu dò (primers và probe).

3.2.4. Etanol tuyệt đối, dùng cho tách chiết mẫu ARN/ADN.

3.2.5. Dung dịch PBS, pH 7,0 (xem Phụ lục A).

3.2.6. Mẫu ARN đối chứng dương, tách chiết từ virus gây bệnh Gumboro, có giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng) đã biết trước.

3.2.7. Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic).

3.2.8. Nước, tinh khiết không có nuclease.

3.3. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp ELISA (phép thử miễn dịch liên kết enzym)

Hiện nay các kít ELISA thương mại có sẵn trên thị trường dùng để phát hiện kháng thể Gumboro. Khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.

Theo tiết 6.2.4.1 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-32:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 32: Bệnh Gumboro ở gia cầm quy định về việc tách chiết ARN như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

....

6.2. Phương pháp realtime RT-PCR phát hiện virus Gumboro

....

6.2.4. Cách tiến hành

6.2.4.1. Tách chiết ARN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.1) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: sử dụng kít tách chiết QIAGEN RNeasy miniKit (Cat. No.74104)1) (xem Phụ lục B)

...

Theo tiêu chuẩn nêu trên thì hiện không có bắt buộc phải sử dụng đúng loại kít tách chiết ARN nào để thực hiện bước tách chiết ARN trong phương pháp realtime RT PCR.

Người thực hiện thí nghiệm chỉ cần sử dụng bộ kít tách chiết thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Có thể sử dụng loại kít tách chiết QIAGEN RNeasy miniKit (Cat. No.74104)1) theo tiêu chuẩn trên để thực hiện.

Bệnh Gumboro ở gà (Hình từ Internet)

Quy trình tách chiết ARN trong phương pháp realtime RT PCR được thực hiện như thế nào?

Theo Phụ lục B Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-32:2015 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán - Phần 32: Bệnh Gumboro ở gia cầm quy trình tách chiết ARN (sử dụng kít QIAGEN RNeasy miniKit) được thực hiện theo các bước như sau:

- Lấy 600 ml dung dịch RLT (lysis buffer) vào ống 1,5 ml;

- Lấy 200 ml mẫu (dịch nổi được xử lý ở 6.2.3) vào ống có chứa dung dịch RLT. Lắc ống bằng máy lắc trong 15 s;

- Cho tiếp 400 ml etanol tuyệt đối (3.2.4) vào ống. Lắc ống bằng máy lắc trong 15 s;

- Chuyển 600 ml dung dịch sang cột lọc (dùng cho tách chiết ARN) đựng trong ống thu, ly tâm với gia tốc 6 000 g trong 15 s;

- Đổ bỏ nước trong ống thu, đặt lại cột lọc vào ống thu và lặp lại bước trên với 600 ml dung dịch còn lại;

- Lấy 700 ml dung dịch RW1 nhỏ vào cột lọc, ly tâm với gia tốc 6 000 g trong 15 s. Đỗ bỏ nước trong ống thu, đặt lại cột lọc vào ống;

- Lấy 500 ml RPE nhỏ vào cột lọc, ly tâm với gia tốc 6 000 g trong 15 s: Đổ bỏ nước trong ống thu, đặt lại cột lọc vào ống. Lặp lại bước này 1 lần nữa;

- Chuyển cột lọc sang ống thu mới. Ly tâm cột lọc với gia tốc 12 000 g trong 2 min;

- Chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml sạch Rnase;

- Nhỏ 50 ml nước sạch Rnase vào cột lọc, ủ trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Ly tâm với gia tốc 10 000 g trong 1 min;

- Bỏ cột lọc, giữ lại ống 1,5 ml có chứa ARN;

- Cất mẫu ARN ở 4 °C trong ngày nếu chạy phản ứng realtime RT-PCR ngay và bảo quản ở âm 20 °C để lưu mẫu trong thời gian dài.