Chuẩn bị mẫu bệnh để tiến hành phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút trên môi trường tế bào nhằm chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép như thế nào?

Nội dung chính

• Bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép là gì? Cá nhiễm bệnh sẽ có những triệu chứng như thế nào?
• Chuẩn bị mẫu bệnh để tiến hành phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút trên môi trường tế bào nhằm chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép ra sao?
• Thực hiện gây nhiễm vi rút bằng phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút trên môi trường tế bào ra sao?

Bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép là gì? Cá nhiễm bệnh sẽ có những triệu chứng như thế nào?

Theo Mục 2 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-7:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép quy định về bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép như sau:

"2 Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

2.1

Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép (Spring Viraemia of Carp - SVC) là bệnh truyền nhiễm do Rhabdovirus.

Bệnh gây xuất huyết cấp tính và nhiễm trùng huyết ở hầu hết các loài cá thuộc họ cá chép và một vài loài cá da trơn (OIE, 2017). Bệnh có nhiều tên gọi khác như: bệnh phù của cá chép, bệnh đốm đỏ cá chép, bệnh viêm bóng hơi cá chép (Swim bladder inflammiation SBI), bệnh vi rút mùa xuân (Spring virus disease).

2.2

Vi rút gây bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép (Spring Viraemia of Carp Virus - SVCV) thuộc giống Vesiculovirus, họ Rhabdovirus có vật chất di truyền là RNA mạch đơn (RNA), bộ gene có 11019 nucleotide mã hóa năm loại protein: Nucleoprotein (N), Phosphoprotein (P), Matrix protein (M), Glycoprotein (G) và protein mã hóa enzyme RNA polymerase (L)."

Theo Mục 5.2 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-7:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép quy định về chẩn đoán lâm sàng như sau:

"5 Chẩn đoán lâm sàng

...

5.2 Triệu chứng lâm sàng

Dấu hiệu bệnh lý đầu tiên là cá bơi ở tầng mặt tụ thành đám ở rìa ao, mất thăng bằng, lờ đờ sau đó chết chìm xuống đáy.

Da có màu tối, mang nhợt nhạt, các tơ mang dính kết lại.

Xuất huyết điểm trên da, mang và ở mắt.

Có thể xuất huyết tràn lan trên da, gốc vây và hậu môn.

Máu loãng chảy ra từ hậu môn.

Cá chết đột ngột không thể hiện dấu hiệu bệnh lý, tỉ lệ chết cao.

..."

Chuẩn bị mẫu bệnh để tiến hành phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút trên môi trường tế bào nhằm chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép như thế nào?

Theo đó, bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép (Spring Viraemia of Carp - SVC) là bệnh truyền nhiễm do Rhabdovirus.

Bệnh gây xuất huyết cấp tính và nhiễm trùng huyết ở hầu hết các loài cá thuộc họ cá chép và một vài loài cá da trơn.

Ở giai đoạn đầu nhiệm bệnh cá sẽ bơi ở tầng mặt tụ thành đám ở rìa ao, mất thăng bằng, lờ đờ sau đó chết chìm xuống đáy.

Da cá sẽ có màu tối, mang nhợt nhạt, các tơ mang dính kết lại; xuất huyết điểm trên da, mang và ở mắt. Ngoài ra, cá chép có thể xuất huyết tràn lan trên da, gốc vây và hậu môn, máu cá sẽ loãng chảy ra từ hậu môn.

Chuẩn bị mẫu bệnh để tiến hành phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút trên môi trường tế bào nhằm chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép ra sao?

Theo Mục 6.4.3 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-7:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép quy định về chuẩn bị mẫu bệnh để tiến hành phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút trên môi trường tế bào nhằm chẩn đoán bệnh xuất huyết mùa xuân trên cá chép như sau:

"6.4.3 Chuẩn bị mẫu

Mẫu bệnh phải được xử lý và tiến hành nuôi cấy trên môi trường tế bào trong vòng 48 h sau khi lấy mẫu

Nghiền mẫu bệnh phẩm trong môi trường phân lập vi rút, tạo thành huyễn dịch có độ pha loãng 1/10 (0,1 g/1 ml)

Pha loãng mẫu bệnh phẩm:

- Ly tâm huyễn dịch mẫu bệnh phẩm (có nồng độ pha loãng 1/10) với tốc độ 2.000 đến 4.000g trong 15 min, ở 4°C;

- Thu dịch trong phía trên và lọc qua màng lọc 0,45 pM (4.3.3). Tiến hành pha loãng với môi trường phân lập vi rút để tạo ra huyễn dịch có nồng độ 1/100.

Bảo quản mẫu và mẫu đã pha loãng ở âm 80 °C để có thể tiếp tục gây nhiễm tế bào ở lần sau.

LƯU Ý: Thực hiện xử lý mẫu trên đá lạnh.

Hệ thống đối chứng: Đối chứng âm (đối chứng tế bào): Chỉ gồm tế bào và môi trường phân lập vi rút."

Mẫu bệnh phải được xử lý và tiến hành nuôi cấy trên môi trường tế bào trong vòng 48 h sau khi lấy mẫu.

Nghiền mẫu bệnh phẩm trong môi trường phân lập vi rút, tạo thành huyễn dịch có độ pha loãng 1/10 (0,1 g/1 ml)

Pha loãng mẫu bệnh phẩm:

- Ly tâm huyễn dịch mẫu bệnh phẩm (có nồng độ pha loãng 1/10) với tốc độ 2.000 đến 4.000g trong 15 min, ở 4°C;

- Thu dịch trong phía trên và lọc qua màng lọc 0,45 pM (4.3.3). Tiến hành pha loãng với môi trường phân lập vi rút để tạo ra huyễn dịch có nồng độ 1/100.

Bảo quản mẫu và mẫu đã pha loãng ở âm 80 °C để có thể tiếp tục gây nhiễm tế bào ở lần sau.

Thực hiện gây nhiễm vi rút bằng phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút trên môi trường tế bào ra sao?

Theo Mục 6.4.4 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-7:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép quy định về việc gây nhiễm vi rút từ mẫu trên tế bào một lớp EPC

"6.4.4 Gây nhiễm vi rút từ mẫu trên tế bào một lớp EPC

Loại bỏ môi trường nuôi cấy tế bào trong đĩa 24 giếng (4.3.1).

Gây nhiễm vi rút với 02 nồng độ (1/10; 1/100) lên tế bào một lớp EPC (3.3.8) đã được nuôi cấy trên đĩa 24 giếng (4.3.1), lượng dung dịch vi rút được gây nhiễm là 150 µl/giếng với từng nồng độ pha loãng, mỗi nồng độ được lặp lại 02 lần. Tiến hành ủ 1 h ở nhiệt độ 15 °C sau đó bổ sung vào mỗi giếng 1,5 ml môi trường phân lập vi rút (Lưu ý: thực hiện với giếng chứa hệ thống đối chứng âm trước, tiếp theo từ giếng có nồng độ vi rút thấp đến nồng độ cao). Nồng độ pha loãng vi rút cuối cùng là 1/100; 1/1000.

Chuyển đĩa 24 giếng đã nhiễm vi rút vào tủ ấm lạnh (4.3.4) và ủ ở nhiệt độ 22 °C đến 25 °C.

Theo dõi sự xuất hiện bệnh lý tế bào (cytopathic effect -CPE) sau 2 ngày gây nhiễm dưới kính hiển vi soi ngược (4.3.5) với vật kính 4X và 10X.

CPE do SVCV trên môi trường tế bào EPC: lúc đầu tế bào co cụm sau đó phồng to hơn và bong khỏi lớp tế bào.

Tiếp tục theo dõi bệnh lý tế bào đến 10 ngày sau khi gây nhiễm, nếu xuất hiện bệnh lý tế bào (CPE) tiến hành thu dịch tế bào có chứa vi rút đem ly tâm 2.000 đến 4.000 g (4.1.6) trong 15 min, ở 4°C.

Thu dịch trong, tách chiết RNA và thực hiện phản ứng RT-PCR hoặc Realtime RT-PCR để xác nhận sự hiện diện của vi rút.

Nếu không xuất hiện CPE, thu hồi huyễn dịch tế bào bằng cách hút dịch tế bào và tế bào đơn lớp bám ở đáy giếng ở các nồng độ (1/10; 1/100) của cùng 1 mẫu vào ống ly tâm 15 ml ly tâm 2.000 đến 4.000g (4.1.6) trong 15 min. Hút dịch trong sau ly tâm (nồng độ gốc) tiến hành pha loãng tạo nồng độ (1/10) rồi tiếp tục nhiễm lên tế bào một lớp EPC (3.3.8) mới trên đĩa 24 giếng (4.3.1). Có thể nhiễm 1 đến 2 lần cấy truyền từ huyễn dịch tế bào của lần cấy truyền thứ nhất. Nếu không có CPE sau 3 lần cấy truyền mẫu được xem là âm tính.

CHÚ THÍCH: Với điều kiện nhiệt độ tại nước ta nên thay môi trường phân lập tế bào định kỳ, điều này sẽ tránh sự phát triển quá mức của tế bào trong quá trình phân lập."

Theo đó, việc gây nhiễm vi rút trong phương pháp nuôi cấy phân lập vi rút trên môi trường tế bào được thực hiện theo Tiêu chuẩn nêu trên.