Cặp mồi sử dụng trong phương pháp PCR để chẩn đoán hội chứng lở loét ở cá là cặp mồi nào? Tiến hành phản ứng PCR trong phương pháp PCR để chẩn đoán hội chứng lở loét ở cá ra sao?

Nội dung chính

• Dung dịch TAE trong thuốc thử dùng để chẩn đoán hội chứng lở loét ở cá bằng phương pháp PCR được điều chế như thế nào?
• Cặp mồi sử dụng trong phương pháp PCR để chẩn đoán hội chứng lở loét ở cá là cặp mồi nào?
• Tiến hành phản ứng PCR trong phương pháp PCR để chẩn đoán hội chứng lở loét ở cá ra sao?

Dung dịch TAE trong thuốc thử dùng để chẩn đoán hội chứng lở loét ở cá bằng phương pháp PCR được điều chế như thế nào?

Theo Phụ lục A Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-14:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) ở cá quy định về dung dịch TAE như sau:

"A.1. Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

A.1.1. Thành phần

Dung dịch TAE (hoặc TBE) 10X: 100 ml

Nước khử ion: 900 ml

Tổng 1000 ml dung dịch TAE (TBE) 1X

A.1.2. Chuẩn bị

Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X hòa chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.2. Thuốc nhuộm Hematoxylin (dung dịch Hematoxylin - Mayer)

A.2.1. Thành phần

Hematoxylin dạng tinh thể:1 g

Natri iodat: 0,2 g

Amoni alum sulphate: (hoặc Postasium alum sulphate) 50 g

Axit citric: 1 g

Chloral hydrate: 50 g

Nước:1000 ml

A.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan Hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và Amoni alum sulphate hoặc kali nhôm sulfat, hòa tan, tiếp tục cho axit citric và chloral hydrate rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

A.3. Thuốc nhuộm Eosin

A.3.1. Thành phần

Eosin Y 1 g

Etanol 70 % (thể tích) 1 lít

Axit axetic: 5 ml

A.3.2. Chuẩn bị

Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào etanol 70 % (thể tích). Hòa tan eosin trong cồn, sau đó thêm axit axetic rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã chuẩn bị trong chai tối màu."

Theo Tiêu chuẩn nêu trên thì để chuẩn bị dung dịch TAE cho việc chẩn đoán hội chứng lở loét ở cá thì cần lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X hòa chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.

Tiến hành phản ứng PCR trong phương pháp PCR để chẩn đoán hội chứng lở loét ở cá ra sao? (Hình từ Internet)

Cặp mồi sử dụng trong phương pháp PCR để chẩn đoán hội chứng lở loét ở cá là cặp mồi nào?

Theo tiết 6.1.4.2 tiểu mục 6.1 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-14:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) ở cá quy định về cặp mồi sử dụng trong phương pháp PCR như sau:

"6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction).

...

6.1.4.2. Chuẩn bị mồi.

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.1.1) theo phương pháp PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của A. invadans sử dụng cặp mồi ITS1-2F/ITSR1 (3.2.1). Trình tự cặp mồi được nêu trong bảng 1.

Cặp mồi ITS1-2F/ITSR1 dùng để khuếch đại đoạn gen của nấm A invadans có kích thước 234 bộ

Mồi được chuẩn bị như sau:

Chuẩn bị mồi gốc:

- Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.1.4) ở gia tốc 6 000g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng đệm TE (3 2 6) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 µM làm mồi gốc.

Chuẩn bị mồi sử dụng:

- Mồi sử dụng ở nồng độ 20 µM: pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.8) (10 µl mồi gốc và 90 µl nước)."

Theo đó, cặp mồi sử dụng trong phương pháp PCR để chẩn đoán hội chứng lở loét trên cá là cặp mồi ITS1-2F và cặp mồi ITSR1.

Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown ở gia tốc 6 000g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên.

Khi hoàn nguyên, nên dùng đệm TE để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 200 µM làm mồi gốc.

Mồi sử dụng ở nồng độ 20 µM: pha loãng mồi gốc bằng nước (10 µl mồi gốc và 90 µl nước).

Tiến hành phản ứng PCR trong phương pháp PCR để chẩn đoán hội chứng lở loét ở cá ra sao?

Theo tiết 6.1.4.3 tiểu mục 6.1 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-14:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) ở cá quy định tiến hành phản ứng PCR như sau:

"6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction).

...

6.1.4.3. Tiến hành phản ứng PCR.

Sử dụng cặp mồi đã chuẩn bị (6.1.4.2) sử dụng kit nhân gen (3.2.9) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kít nhân gen của Thermo Scientific Dream Tag PCR Master Mix (2X) (Lot: 00316656)2)

Thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng 2

Chuyển 22,5 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu kiểm chứng dương: Cho 2,5 µl mẫu ADN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng Aphanomyces invadans chuẩn vào ống phản ứng;

- Mẫu kiểm chứng âm: Cho 2,5 µl nước (3.2.8) vào ống phản ứng;

- Mẫu thử: Cho 2,5 µl mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.1.1) để cài đặt chu trình nhiệt và được nếu trong bảng 3.

CHÚ THÍCH.

- Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu kiểm chứng dương và mẫu kiểm chứng âm;

- Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng"

Sử dụng cặp mồi đã chuẩn bị và sử dụng kit nhân gen để tiến hành phản ứng PCR theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kít nhân gen của Thermo Scientific Dream Tag PCR Master Mix (2X) (Lot: 00316656)2). Chuyển 22,5 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu kiểm chứng dương: Cho 2,5 µl mẫu ADN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng Aphanomyces invadans chuẩn vào ống phản ứng;

- Mẫu kiểm chứng âm: Cho 2,5 µl nước (3.2.8) vào ống phản ứng;

- Mẫu thử: Cho 2,5 µl mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.1.1) để cài đặt chu trình nhiệt

Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu kiểm chứng dương và mẫu kiểm chứng âm;

Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng