Cặp mồi sử dụng trong phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh Perkinsus Marinus ở hàu cần được chuẩn bị ra sao?

Nội dung chính

• Mẫu bệnh phẩm dùng để chẩn đoán bệnh Perkinsus Marinus ở hàu bằng phương pháp PCR cần được chuẩn bị như thế nào?
• Cặp mồi sử dụng trong phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh Perkinsus Marinus ở hàu cần được chuẩn bị ra sao?
• Phản ứng PCR trong phương pháp PCR nhằm chẩn đoán bệnh Perkinsus Marinus ở hàu được thực hiện như thế nào?

Mẫu bệnh phẩm dùng để chẩn đoán bệnh Perkinsus Marinus ở hàu bằng phương pháp PCR cần được chuẩn bị như thế nào?

Theo tiết 6.2.1, 6.2.2 và tiết 6.2.3 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-10:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chuẩn đoán - Phần 10: Bệnh do Perkinsus Marinus ở nhuyễn thể hai mảnh nhỏ quy định về việc chuẩn bị mẫu như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

6.2.1. Lấy mẫu

Xem 6.1 1.

6.2.2. Bảo quản mẫu

Trong quá trình vận chuyển, mẫu được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C không quá 24 h hoặc bảo quản trong etanol tuyệt đối (3.2.1);

Mẫu chuyển đến phòng thí nghiệm nếu chưa phân tích ngay phải bảo quản mẫu ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 60 °C hoặc trong etanol tuyệt đối (3.2.1).

6.2.3. Chuẩn bị mẫu

Lượng mẫu cần chuẩn bị: khoảng 30 mg.

a) Mẫu trực tiếp

Thực hiện chuẩn bị mẫu như mô tả tại 6.1.3;

Bảo quản mẫu trong etanol tuyệt đối (3.2.1);

Trước khi tách chiết, lấy mẫu ra khỏi etanol và làm khô bằng giấy thấm.

b) Mẫu tăng sinh

Thực hiện như mô tả tại bước 1 và bước 2 của 6.1.4;

Dùng panh vô trùng lấy mẫu bệnh phẩm ra khỏi môi trường FTM và đặt vào ống eppendorf 1,5 ml (4.2.8) để tách chiết ADN.

...

Dẫn chiếu tiết 6.1.1 tiểu mục 6.1 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-10:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chuẩn đoán - Phần 10: Bệnh do Perkinsus Marinus ở nhuyễn thể hai mảnh nhỏ quy định như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1. Phương pháp nuôi cấy

6.1.1. Lấy mẫu

Số lượng nhuyễn thể hai mảnh vỏ trên mỗi mẫu tùy thuộc vào kích cỡ của nhuyễn thể nhuyễn thể hai mảnh vỏ:

- Nhuyễn thể hai mảnh vỏ giống: lấy từ 10 con/mẫu đến 15 con/mẫu.

- Nhuyễn thể hai mảnh vỏ trưởng thành: lấy từ 5 con/mẫu đến 10 con/mẫu.

Theo đó, khi tiến hành chẩn đoán bệnh Perkinsus Marinus ở hàu bằng phương pháp PCR thì cần chuẩn bị đủ sổ lượng mẫu bệnh phẩm như sau:

- Nhuyễn thể hai mảnh vỏ giống: lấy từ 10 con/mẫu đến 15 con/mẫu.

- Nhuyễn thể hai mảnh vỏ trưởng thành: lấy từ 5 con/mẫu đến 10 con/mẫu.

Trong quá trình vận chuyển, mẫu được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C không quá 24 h hoặc bảo quản trong etanol tuyệt đối (3.2.1);

Mẫu chuyển đến phòng thí nghiệm nếu chưa phân tích ngay phải bảo quản mẫu ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 60 °C hoặc trong etanol tuyệt đối

Nếu lấy mẫu bệnh phẩm trực tiếp thì phải dùng mẫu còn sống hoặc vừa chết chưa tách vỏ; dùng dao mổ vô trùng cắt cơ mở vỏ nhuyễn thể hai mảnh vỏ và tách ra làm hai; dùng panh, kéo vô trùng cắt 1 mẫu bệnh phẩm từ 5 mm đến 10 mm của phần mô áo, mang, ruột, phần cơ bị tổn thương;

Nếu dùng mẫu tăng sinh thì cho mẫu bệnh phẩm đã chuẩn bị vào các ống nghiệm chứa 9,5 ml FTM có bổ sung thêm 0,5 ml dung dịch penicilin-streptomycin (3.1.2) và 50 ml nystatin. Ống nghiệm được đóng kín và lắc để mẫu bệnh phẩm chìm trong môi trường. Ủ ống nghiệm chứa mẫu bệnh phẩm trong điều kiện không có ánh sáng, ở nhiệt độ từ 22 °C đến 25 °C trong 5 ngày đến 7 ngày.

Cặp mồi sử dụng trong phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh Perkinsus Marinus ở hàu cần được chuẩn bị ra sao? (Hình từ Internet)

Cặp mồi sử dụng trong phương pháp PCR để chẩn đoán bệnh Perkinsus Marinus ở hàu cần được chuẩn bị ra sao?

Theo tiết 6.2.4.2 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-10:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chuẩn đoán - Phần 10: Bệnh do Perkinsus Marinus ở nhuyễn thể hai mảnh nhỏ quy định về việc chuẩn bị mồi để tiến hành phương pháp PCR như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

...

6.2.4.2. Chuẩn bị mồi

Pnản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.2.1) theo phương pháp PCR khuếch đạt đoạn gen đặc hiệu của Perkinsus marinus sử dụng cặp mồi PmarlTS-70F/PmarlTS600R (3.2.4). Trình tự cặp mồi được nêu trong Bảng 1.

Cặp mồi PmarlTS-70F/PmarlTS600R dùng để khuếch đại đoạn gen của Perkinsus marinus có kích thước 509 bp.

Mồi được chuẩn bị như sau:

Chuẩn bị mồi gốc:

- Mồi gốc ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.2.4) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.10) được mồi ở nồng độ 200 mM làm mồi gốc;

Chuẩn bị mồi sử dụng:

- Mồi sử dụng ở nồng độ 20 mM: pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.5) (10 ml mồi gốc và 90 ml nước (3.2.5)).

Theo đó, việc chuẩn bị cặp mồi cho phương pháp PCR để tiến hành chẩn đoán bệnh Perkinsus marinus ở hàu được thực hiện như sau:

- Mồi gốc ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE được mồi ở nồng độ 200 mM làm mồi gốc;

Chuẩn bị mồi sử dụng:

- Mồi sử dụng ở nồng độ 20 mM: pha loãng mồi gốc bằng nước (10 ml mồi gốc và 90 ml nước.

Phản ứng PCR trong phương pháp PCR nhằm chẩn đoán bệnh Perkinsus Marinus ở hàu được thực hiện như thế nào?

Theo tiết 6.2.5.3 tiểu mục 6.2 Mục 6 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-10:2015 về Bệnh thủy sản - Quy trình chuẩn đoán - Phần 10: Bệnh do Perkinsus Marinus ở nhuyễn thể hai mảnh nhỏ quy định về các bước tiến hành phản ứng PCR như sau:

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

...

6.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

...

6.2.4.3. Tiến hành phản ứng PCR

Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị (6.2.4.2) sử dụng kít nhân gen (3.2.3) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Sử dụng kit nhân gen của Themo Scientific Dream Tag PCR Master Mix (2X) (Lot: 00316656)2)

Thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng 2

Chuyển 22,5 ml hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

- Mẫu kiểm chứng dương: Cho 2,5 ml mẫu ADN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng Perkinsus marinus chuẩn vào ống phản ứng;

- Mẫu kiểm chứng âm: Cho 2,5 ml nước (3.2.5) vào ống phản ứng:

- Mẫu thử: Cho 2,5 ml mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.2.1) đã cài đặt chu trình nhiệt được nêu trong bảng 3.

CHÚ THÍCH:

- Phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu kiểm chứng dương và mẫu kiểm chứng âm;

- Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

...

Như vậy, phản ứng PCR trong phương pháp PCR được thực hiện theo tiêu chuẩn nêu trên.

Lưu ý: phản ứng PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu kiểm chứng dương và mẫu kiểm chứng âm. Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.