Các loại thuốc thử nào cần phải chuẩn bị để dùng cho việc chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm sú giống? Quy trình tách chiết ADN sử dụng kít tách chiết ADN của Qiagen được thực hiện như thế nào?

Nội dung chính

• Cần sử dụng những loại thuốc thử, vật liệu thử nào để thực hiện chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm sú giống?
• Các loại thuốc thử nào cần phải chuẩn bị để dùng cho việc chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm sú giống?
• Quy trình tách chiết ADN sử dụng kít tách chiết ADN của Qiagen đươc thực hiện như thế nào?

Cần sử dụng những loại thuốc thử, vật liệu thử nào để thực hiện chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm sú giống?

Theo Mục 3 TCVN 8710-3:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm quy định về thuốc thử và vật liệu thử ở tôm sú giống khi có biểu hiện bệnh như sau:

"3 Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ các trường hợp có quy định khác.

3.1 Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung

3.1.1 Etanol, từ 96 % đến 100 % (C2H6O).

3.1.2 Dung dịch muối đệm phốt phát (PBS).

3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR và realtime PCR

3.2.1 Cặp mồi, gồm mồi xuôi và mồi ngược.

3.2.2 Cặp mồi, gồm mồi xuôi và mồi ngược, Dò.

3.2.3 Kít tách chiết ADN (Xem B1 và B2)

3.2.4 Kít nhân gen PCR (PCR Master Mix Kit, Cat. No K0171).

3.2.5 Kít nhân gen Realtime PCR ( ví dụ: Kít Platinum® Quantitative PCR SuperMix-UDG, Cat.No: 11730-017).

3.2.6 Dung dịch đệm TAE (Tris - acetate - EDTA) hoặc TBE (Tris - brorate - EDTA) (xem A.1).

3.2.7 Chất nhuộm màu, ví dụ: Sybr safe.

3.2.8 Chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X).

3.2.9 Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic).

3.2.10 Thang chuẩn AND (Ladder).

3.2.11 Nước tinh khiết, không có nuclease.

3.2.12 Agarose."

Như vậy, khi thực hiện chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm thì sử dụng các thuốc thử và vật liệu thử vừ nêu trên theo Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8710-3:2019.

Các loại thuốc thử nào cần phải chuẩn bị để dùng cho việc chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm?

Các loại thuốc thử nào cần phải chuẩn bị để dùng cho việc chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm sú giống?

Theo Phụ lục A TCVN 8710-3:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm quy định về môt số loại thuốc thử và chuẩn bị thuốc thử như sau:

"A.1 Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

A.1.1 Thành phần

Dung dịch TAE (hoặc TBE) 10X: 100 ml

Nước khử ion: 900 ml

Tổng: 1000 ml dung dịch TAE (TBE) 1X

A.1.2 Chuẩn bị

Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X hòa chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.2 Dung dịch Davidson

A.2.1 Thành phần

Etanol (96%): 330 ml

Formalin: 220 ml

(dung dịch nước bão hòa khí formaldehyde là dung dịch từ 36 % đến 38 %)

Axit acetic: 115 ml

Nước cất: 355 ml

A.2.2 Chuẩn bị

Hòa tan axit acetic, formalin và etanol trong 355 ml nước cất, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.3 Dung dịch muối đệm phosphat (PBS)

A.3.1 Thành phần

Natri clorua (NaCl) 8 g

Natri hydro photphat dihydrat (Na2HPO4.2H2O) 2,9 g

Kali dihydro photphat (KH2PO4) 0,2 g

Kali clorua (KCl) 0,2 g

Nước cất 1000 ml

A.3.2 Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên vào 1000ml nước cất, khuấy và lắc đều.

Chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp vô trùng ở 121 °C trong 30 min."

Theo đó, các loại thuốc thử cần phải chuẩn bị bao gồm:

- Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

- Dung dịch Davidson

- Dung dịch muối đệm phosphat (PBS)

Việc chuẩn bị thuốc thử phải thực hiện theo đúng các bước là liều lượng thành phần được quy định tại Phục lục A Tiêu chuẩn quốc gia nêu trên.

Quy trình tách chiết ADN sử dụng kít tách chiết ADN của Qiagen đươc thực hiện như thế nào?

Theo Mục B.1 Phục lục B TCVN 8710-3:2019 về Bệnh thủy sản - Quy trình chẩn đoán - Phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm quy định về quy trình tách chiết ADN sử dụng kít tách chiết ADN của Qiagen như sau:

"B.1. Quy trình tách chiết ADN sử dụng kít tách chiết ADN của Qiagen

VÍ DỤ: Sử dụng kit tách chiết ADN của Qiagen: DNeasy® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506)

Chuyển 30 mg bệnh phẩm vào ống eppendort, thêm 180 µl dung dịch ATL, thêm 20 µl protease K vào, lắc đều bằng máy lắc trộn vortex (4.1.4);

- Ủ ở 56 °C cho đến khi hoàn toàn đồng nhất (thỉnh thoảng lắc bằng máy lắc trộn vortex (4.1.4) trong quá trình ủ ). Lắc đều bằng máy lắc trộn vortex (4.1.4);

- Thêm 200 µl dung dịch AL (Lysis buffer). Lắc đều bằng máy lắc trộn vortex (4.1.4);

- Ủ ấm ở 56 °C trong 10 min;

- Thêm 200 µl etanol (từ 96 % đến 100 %) vào ống eppendort. Lắc đều bằng máy lắc trộn vortex (4.1.4);

- Hút huyễn dịch trong ống eppendort, chuyển sang cột lọc có ống thu ở dưới;

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.3) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Thay ống thu ở dưới cột lọc;

- Thêm 500 µl dung dịch AW1 (Wash buffer 1) vào cột lọc có ống thu ở dưới;

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.3) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

- Thay ống thu ở dưới cột lọc;

- Thêm 500 µl dung dịch AW2 (Wash buffer 2) vào cột lọc có ống thu ở dưới;

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.3) với gia tốc 20 000 g trong 3 min ở nhiệt độ phòng;

- Chuyển cột lọc sang ống eppendort 1,5 ml;

- Nhỏ 200 µl dung dịch AE (Elution buffer) vào cột ly tâm và giữ ở nhiệt độ phòng 1 min;

- Ly tâm bằng máy ly tâm (4.1.3) với gia tốc 6 000 g trong 1 min;

- Chuyển ADN đã thu được sang ống eppendort 1,5 ml khác.- Bảo quản mẫu ADN ở 2-8°C trong vài tuần và -20°C trong thời gian lâu"

Theo đó, người tiến hành thử nghiệm cần chuyển 30 mg bệnh phẩm vào ống eppendort, thêm 180 µl dung dịch ATL, thêm 20 µl protease K vào, lắc đều bằng máy lắc trộn vortex (4.1.4) khi sử dụng kit tách chiết ADN của Qiagen: DNeasy® Blood & Tissue Kit (250) (Cat No. 69506). Sau đó tiến hành thực hiện các bước theo quy định đã nêu trên